草炭強化對油田陳化油泥生物修復工程效果的影響

盧桂蘭，王世杰，郭觀林，王翔，張玉，張朝，李發生*

1.中國環境科學研究院土壤污染與控制研究室，北京 100012

2.北京科技大學土木與環境工程學院，北京 100083

含油污泥具有產生量大、含油量高、重質組分多和難處理等特點，是石油生產過程中的主要污染物之一［1］。含油污泥減量化、無害化、資源化處理技術逐漸成為研究熱點，目前主要的處理方式分為物理法、化學法和生物法。生物修復具有修復效果好、處理費用低，無二次污染、對環境影響小、公眾接受度高等特點，被認為具有廣闊的應用前景［2］。近年來，堆肥法成為陳化油泥最常用的生物修復技術［3］，堆肥法和土耕法修復原理相似，主要針對石油類污染引起的土壤理化性質變化，如堵塞土壤孔隙，土壤鹽堿化、膠質化、板結化等特性，通過添加干草、割草、樹葉、小麥秸稈和肥料等生物基質，提高堆肥效果［4-5］，對去除高濃度不穩定固體的有機復合物最有效。研究表明，添加外源石油降解菌和采取適當措施刺激土著微生物均能大幅降低土壤中的石油污染物濃度，改善土壤的理化性質，降低其生物毒性。葉小梅等研究了調理劑類型和添加量對污泥中石油類污染物生物降解的影響，研究發現添加木屑的效果最好，蛭石次之，稻草最差［6］。針對露天堆放了近30年的陳化油泥，筆者以草炭作為生物基質，采用土耕法進行生物修復試驗，同時設置自然衰減為對照，分別測定了修復前后陳化油泥的理化性質，總石油烴(TPH)，石油組分，土壤微生物數量及群落變化等，以期為開發針對油田陳化油泥的修復技術提供理論依據和工作經驗。

1 材料與方法

1.1 現場修復試驗及樣品處理

陳化油泥生物修復試驗工程位于某采油廠聯合站。該地區年均氣溫 11～14℃，年日照時數2300～2900 h，日照率52%～65%，年均降水量550～950 mm，多集中在6—9月;無霜期180～220 d，冬季140～150 d，夏季72～108 d，春秋各50～70 d，屬于暖溫帶半濕潤季風氣候。該地區為渤海海岸淺灘地帶，土壤類型以沖積型沙質土壤為主，土壤透氣性能好［7］。經現場采樣分析，表層土壤中TPH濃度約為200000 mg/kg，大大超過GB 4284—84《農用污泥中污染物控制標準》規定的土壤中礦物油濃度最高限值(3000 mg/kg)。

草炭強化生物修復陳化油泥試驗設置3個試驗區及1個自然衰減對照區(均為2.3 m×1.5 m×0.4 m)，油泥與草炭按質量比1∶1混合均勻，試驗區概況如圖1所示。試驗區每個月深翻1次，分別在修復1，2，4，9，13，16 和 26 個月時采樣分析。各試驗區按多點混合法采樣，每個混合樣由10個樣點組成。樣品于4℃下保存。

樣品預處理步驟。1)冷凍干燥:將采集的樣品放入實驗盤中，揀出其中的碎石、砂礫、植物殘體，進行壓碎、翻動、攪拌，使樣品充分混合后置于-4℃冰箱中冷凍，再放入預冷好的干燥器中進行冷凍干燥(-57℃，300 Pa)24 h以上，使樣品充分干燥;2)樣品的選取:將冷凍干燥好的樣品充分混合均勻，用碾缽磨細過篩(60目)，按四分法進行縮分。

圖1 陳化油泥生物修復現場試驗概況Fig.1 Overview of field research construction for bioremediation of oily sludge

1.2 草炭理化性質分析

草炭購自吉林省某公司，粉碎至10目左右，并按標準測試方法進行相關理化性質分析(表1)。

1.3 陳化油泥理化性質分析［8］

陳化油泥中TPH及石油組分的分析，以三氯甲烷為溶劑，通過快速溶劑萃取儀(美國戴安，ASE300)萃取，測定油泥中的總含油量。石油組分采用棒薄層火焰離子化法(TLC-FID)測定，棒薄層火焰離子化分析儀(日本，IATROSCAN MK6S)參數設定:空氣和氫氣流量分別為2000和60 mL/min，掃描速度為40 s/次。重金屬濃度采用電感耦合等離子體質譜(Agilent Technologies ICP-MS 7500 Series)分析。

表1 草炭基本理化性質Table 1 Basic physicochemical properties of peat

陳化油泥的基本理化性質指標:pH用LY/T 1239—1999《森林土壤pH的測定》方法測定，離子交換量〔(CEC)，cmol(+)/kg〕用 LY/T 1243—1999《森林土壤陽離子交換量的測定》方法測定，全鹽量用LY/T 1251—1999《森林土壤水溶性鹽分分析》方法測定;陳化油泥的其他基本理化性質指標，如密度、有機質、有效氮、有效磷和有效鉀等測試方法參照表1。

1.4 陳化油泥中微生物數量及生物多樣性分析

陳化油泥中微生物數量采用逐級稀釋平板計數法測定:準確稱取10 g處理后的土樣，放入裝有90 mL無菌水并放有小玻璃珠的錐形瓶中(已滅菌)，用漩渦混合振蕩器振蕩2 min，使微生物細胞充分分散，靜置20～30 s，制成稀釋度為10-1的稀釋菌液;用1 mL無菌吸管，吸取稀釋度為10-1的稀釋菌液1 mL，放入裝有9 mL無菌水的試管(已滅菌)中，使菌液混合均勻，制成稀釋度為10-2的稀釋菌液;依此類推，連續稀釋，制成8個稀釋度的稀釋菌液。取稀釋度為 10-5，10-6，10-7和 10-8的稀釋菌液各 0.1 mL，用涂布法均勻涂布在牛肉膏蛋白胨瓊脂平板上，倒置，37℃培養48 h。菌落計數方法:選取平均菌落數在30～300 CFU的平板，以菌落數乘以稀釋倍數，計算出1 g土壤樣品中含有的菌落數［9］。

生物多樣性分析采用菌落Biolog ECO板(Biolog Inc，Hayward，CA)。測定菌落吸光度的分析方法:準確稱取10 g處理后的土樣于250 mL的錐形瓶中，加入100 mL 0.75%的生理鹽水，將錐形瓶放入振蕩器中充分振蕩，轉速100 r/min，振蕩30 min，取土壤提取液10 mL，再用生理鹽水稀釋10倍。將稀釋好的土壤提取液加樣到Biolog ECO微平板上。每孔50 μL，每樣1板(包括3個平行測定)，將Biolog ECO微平板置于25℃恒溫箱中培養，24 h后用Biolog讀數儀讀數，將此次讀數設為初始值，之后每隔24 h讀數1次，連續讀數7次。分別用菌落平均每孔顏色變化率(AWCD)值，Simpson指數和McIntosh指數表征微生物群體利用碳源能力的多樣性［10-11］。

2 結果與討論

2.1 修復前陳化油泥的理化性質及微生物數量

修復前陳化油泥的基本理化性質:油泥中TPH濃度為27%，其中非烴濃度為26%，瀝青質濃度為10%;汞、鉛、鎘、銅、鋅等重金屬濃度均未超過GB 15618—1995《土壤環境質量標準》二級標準限值;微生物活菌數為50 CFU/g。

2.2 修復后對陳化油泥理化性質的影響

草炭強化生物修復能夠改善陳化油泥的理化性質，有利于提高土著微生物的降解活性，從而提高石油烴類污染物的生物降解率。經過26個月處理，發現經陳化油泥草炭強化生物修復后，其理化性質得到顯著改善:pH從8.7降至6.9，密度從2.7 g/cm3降至 1.2 g/cm3，有機質濃度從 1.2%增加為17.3%，全鹽量從20.3 g/cm3降至7.3 g/kg，CEC增加約1倍(表2)。

表2 草炭強化生物修復前后陳化油泥的基本理化性質Table2 Physicochemical properties of aged oily sludge after 26 months'bioremediation with peat

研究表明，大多數土壤中微生物最適pH為中性范圍，環境中的pH變化對微生物的影響很大，它通過引起細胞電荷的變化，影響代謝中酶的活性和細胞質膜的透性及穩定性，從而影響微生物對營養物質的吸收及石油烴生物降解速率［12-13］。通過添加草炭強化生物修復陳化油泥，主要是利用草炭中含有的大量有機酸分子、其具有的較大總表面積和較強的鹽堿緩沖能力來調節陳化油泥的酸堿度，使其調整到適合微生物生長的范圍［14］。王傳遠等認為油泥污染土壤中，通常含碳量較高，而微生物所需要的氮、磷等元素的相對缺乏，建議在進行石油修復中添加相應的營養元素來增強土壤微生物的活性［15-16］。筆者的研究中陳化油泥經草炭強化生物修復后土壤中有效態的營養元素顯著提高，有效氮、有效磷和有效鉀的濃度分別增加到184.0，3.0和146.0 mg/kg。草炭是鹽堿及荒漠化治理的有效生物基質，在研究中草炭強化生物修復陳化油泥的作用還表現在3個方面:1)石油污染通常伴隨鹽堿產生，鹽度太高對微生物生長具有顯著的影響［17］。試驗結果表明，草炭強化生物修復陳化油泥后鹽濃度顯著降低(表2)，有利于石油類污染物的微生物降解［18］。2)草炭結構中的官能團與土壤中膠體表面的官能團或化學鍵發生物理化學吸附作用，從而形成有機-無機復合體等團粒結構，有利于陳化油泥的孔隙度增加，密度下降［12］。3)采用草炭強化處理后，陳化油泥中有機質的濃度顯著提高，其中一個重要原因是草炭本身含有大量的有機碳和腐殖酸［19］。

2.3 草炭強化生物修復對陳化油泥中TPH生物降解效果的影響

隨降解時間的增加，自然衰減區和草炭強化生物修復區的陳化油泥中TPH濃度都呈現下降趨勢，自然衰減區中TPH濃度從10.6 mg/g降至9.0 mg/g，草炭強化生物修復區中TPH濃度從12.4 mg/g降至7.6 mg/g。經過26個月降解，草炭強化生物修復區與自然衰減區中的陳化油泥TPH降解率存在明顯差異:自然衰減區降解率為14.9%，草炭強化生物修復區的降解率為38.9%(圖2)。

圖2 草炭強化生物修復對陳化油泥中TPH生物降解率的影響Fig.2 Influence of peat on the biodegradation efficiency of TPH in oily sludge

自然衰減處理陳化油泥主要依靠土著微生物對石油烴類污染物的降解。宋玉芳等認為，污染物的降解在很大程度上依靠土著微生物的降解能力［20］。王震宇等研究證明，黃河三角洲鹽漬化土壤中土著菌對石油烴具有較強的降解能力，原油生物降解率達到70.7%［21］。金文標等研究發現，油污土壤經90 d自然降解，其原油降解率達24.5%，并且添加原油降解菌和營養物，能夠使石油生物降解效率提高20.7%［22］。試驗發現，現場土著微生物對油泥自然衰減發揮重要作用。

通過深翻耕及添加草炭的方式，經過26個月現場降解試驗，陳化油泥的TPH降解率達38.9%。由于陳化油泥黏著力強，嚴重限制了氧氣的傳輸，形成厭氧或缺氧的環境，影響了石油的降解速率［23-24］。通過翻耕和添加草炭等，改善了土壤理化性質，增加了土壤透氣性和單位體積內的供氧量，促進了微生物的活性，Embar等通過添加蛭石的方法提高土壤的通透性，使石油的降解率提高了近20%［25］。研究發現，添加草炭能顯著促進陳化油泥的降解，其主要原因有3個方面:1)草炭對石油污染物具有一定的吸附作用［26-27］;2)陳化油泥中添加草炭可顯著增加有機質濃度(表2)，已有研究結果表明，通過添加稻草、有機肥、玉米芯、樹皮碎片等生物基質，土壤中石油降解率顯著增加［28-30］;3)草炭中的腐殖酸具有表面活性劑增溶作用，能促進石油烴類污染物的解吸附，并提高微生物對土壤中殘留石油的降解［31］。

2.4 草炭強化生物修復對陳化油泥中石油組分降解效果的影響

研究表明，經過自然衰減和草炭強化生物修復處理的陳化油泥，其殘留石油烴組分相對濃度變化趨勢一致:飽和烴、芳香烴、瀝青質均呈下降趨勢，非烴呈上升趨勢，生物降解率表現為飽和烴＞芳香烴＞瀝青質＞非烴(圖3)，其他研究結果也表明，陳化油泥中石油組分的生物降解呈現相似的規律［13，32-33］。由于原油中含有大量的 S，N 和 O 等非烴類化合物(主要為硫醇、噻吩、卟啉、喹啉、環烷酸、脂肪酸及酚、酮類化合物)，這些物質通常不易分解，因此降解過程中非烴類污染物的相對密度逐漸增加［34］。此外，非烴類物質使石油黏稠，并造成土壤板結，透氣性差，導致微生物、植物生長處于厭氧環境，常需輔以其他修復方法(化學萃取法、焚燒法、物理破碎等)處理陳化油泥，提高生物修復效率，降低對土壤的危害。如圖3所示，在自然衰減與草炭強化降解的陳化油泥樣品中，瀝青質濃度明顯減小，說明在一定條件下瀝青質也能部分被生物降解［35］，通過選擇適合的微生物菌株利用膠質和瀝青質作為唯一碳源［36-37］。

2.5 草炭強化生物修復對微生物數量和生物多樣性的影響

在生物修復開始時(降解時間為0月)，草炭強化生物修復區的陳化油泥中微生物數量比自然衰減區的高2個數量級，說明添加草炭能迅速增加陳化油泥中的微生物數量，因為草炭中含有大量的外源性微生物菌群。研究表明，微生物降解石油烴污染物的過程中，微生物數量是影響降解速率的重要因素［9］。對草炭強化生物修復區26個月中的5次微生物數量監測結果見表3。

圖3 草炭強化生物降解對陳化油泥中石油烴組分的影響Fig.3 Influence of peat on change of hydrocarbons components in bioremediation of aged oily sludge

表3 草炭強化生物修復區微生物數量監測結果Table 3 Monitoring results of microorganisms quantity in peat-enhanced bioremediation region

由表3可見，微生物數量隨時間的增加呈下降趨勢，其下降原因有待進一步研究，初步推測是石油的毒害作用及土壤中有效態營養元素濃度的影響［38-42］。Kaufmann等研究發現，在長期的石油污染土壤中，對環境敏感的微生物種群類型和數量呈下降趨勢，逐漸被具有石油降解能力的微生物所代替［43-45］，因此只有適應高含油量的微生物才能存活。環境介質中烴類污染物生物降解代謝，往往是不同種屬微生物共同作用的結果［46］。AWCD值，Simpson指數和McIntosh指數是反映微生物群落整體活性的有效指數，從群落Biolog多樣性指數中可以得出:生物修復開始時(降解時間為0月)，草炭強化生物修復處理的AWCD值，Simpson指數和McIntosh指數均大于自然衰減對照(表4)，表明草炭的添加能夠提高陳化油泥中微生物的多樣性，證實了添加草炭后土壤中的微生物數量較純油泥污染顯著增加;但陳化油泥經過了26個月的生物降解，草炭強化生物修復處理的AWCD值，Simpson指數和McIntosh指數值均有所減小，說明其微生物多樣性的減少，也證實了石油污染對微生物種群的選擇性影響。該現象的產生，可能與草炭能夠產生腐殖酸和提供N，P等營養元素有關。研究表明，在一定時期內營養物質濃度是影響微生物數量及污染物降解率的主要因素［47］，添加N和P營養能夠顯著提高石油降解菌數量和活性［48］，施用腐殖酸肥料可促進土壤微生物的繁殖及酶活性的增加［49］。

表4 草炭強化生物修復對陳化油泥中微生物數量和微生物多樣性的影響Table 4 Influence of peat on the microbial quantity and biodiversity of aged oily sludge

3 結論

(1)草炭強化生物修復對陳化油泥具有較好的修復效果，經過26個月的降解過程，TPH降解率達到38.9%，較自然衰減的降解率(14.9%)提高了24%。其中對石油組分中的飽和烴、芳香烴的降解率較大，對瀝青質也具有一定的降解效果。

(2)草炭強化生物修復對陳化油泥的理化性質具有明顯改善作用，能有效調節陳化油泥鹽堿濃度(從20.3 g/kg降至7.3 g/kg)和酸堿度(pH從8.7降至6.9)，提高了土壤的有機質濃度(從1.2%增加為17.3%)，CEC增加約1倍，有效態營養元素濃度顯著提高，微生物生長環境的改善，提高了石油烴類污染物的降解效率。

(3)與自然衰減對照相比，添加草炭后，陳化油泥中微生物數量(增加2個數量級)、活性和微生物多樣性明顯增加，在陳化油泥生物修復過程中補充草炭等生物基質，可以作為提高工程修復效果的有效手段。

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