PTEN在小鼠卵細胞和早期胚胎發育中的功能研究

王喜宏, 和協超, 韓樹標, 季維智, 鄭 萍

(1. 中國科學院昆明動物研究所, 云南 昆明 650223; 2. 中國科學院研究生院, 北京 100049)

PTEN在小鼠卵細胞和早期胚胎發育中的功能研究

王喜宏1,2,*, 和協超1, 韓樹標1, 季維智1, 鄭 萍1

(1.中國科學院昆明動物研究所,云南 昆明650223; 2.中國科學院研究生院,北京100049)

PI3K/AKT信號通路在哺乳動物早期胚胎發育中起重要作用。抑癌基因PTEN是該通路中的負調節因子, 但PTEN在卵和早期胚胎中的表達、分布以及作用都還未見報道。本研究通過免疫熒光方法發現卵細胞及著床前胚胎都表達PTEN, 且具活性的PTEN主要分布在生發泡期(germinal vesical, GV)卵細胞的皮層部位以及致密桑椹胚的卵裂球表面。在培養基中添加低濃度的PTEN特異性抑制劑bpV(pic), GV期卵母細胞的成熟不受影響, 但著床前胚胎發育受到阻滯。該結果提示PTEN在小鼠著床前胚胎發育中可能起重要作用。

卵細胞; 著床前胚胎發育; PTEN; bpV

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族參與多種信號通路, 調節細胞的多種功能。正常情況下, 由其活化而產生的類脂產物3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇PtdIns(3,4,5)P3(PIP3)作為第二信使結合并激活多種細胞內的靶蛋白, 形成一個信號級聯復合物, 最終調節細胞的增殖、分化、存活和遷移等(Manning & Cantley, 2007)。PI3K/AKT信號通路保持正常的平衡狀態是細胞維持正常生理活動的關鍵。PTEN是一種PtdIns(3,4,5)P3-磷酸酶, 它可以通過去磷酸化將PtdIns(3,4,5)P3轉變為PtdIns(4,5)P2(PIP2), 從而負調節PI3K/AKT信號通路的穩態。PIP2也是一種重要的信號分子，可以與胞內或細胞膜上的許多蛋白質發生相互作用(McLaughlin & Murray,2005)。 PTEN的異常與多種腫瘤的發生、侵襲及轉移密切相關(Keniry & Parsons, 2008)。因此，PTEN是重要的抑癌因子之一, 在調節細胞正常生長也有著舉足輕重的作用。

對PI3K信號通路在生殖和發育中的功能研究則相對較少, 但已有證據表明PI3K對著床前胚胎發育具重要意義。敲除PI3K的p110b催化亞基會引發早期胚胎致死(Bi et al, 2002)。應用時差顯微技術(time lapse microscopy)也發現早期胚胎中有持續的PtdIns(3,4,5)P3生成, 抑制 PtdIns(3,4,5)P3的產生可導致胚胎發育受阻, 說明PI3K/Akt通路對早期胚胎發育起調控作用(Halet et al, 2008)。在卵細胞中特異性敲除PTEN, 可使濾泡提前發育和過度激活, 從而產生卵巢早衰(Reddy et al, 2008);而在顆粒細胞中特異敲除PTEN則可以增加排卵率和產仔數并延長黃體壽命(Fan et al, 2008)。在小鼠初級卵泡中特異敲除PTEN不能影響卵母細胞成熟、排卵和產仔數(Jagarlamudi et al, 2009)。但是到目前為止, PTEN是否也在早期胚胎中表達并起一定的調控作用, 尚未見有關報道。我們利用免疫組化技術研究PTEN在小鼠卵和著床前胚胎中的分布, 并利用PTEN特異性抑制劑研究其在卵成熟及早期胚胎發育中的可能功能，其結果表明, PTEN在卵細胞和早期胚胎中持續表達, 對早期胚胎發育可能起調控作用, 但抑制PTEN對卵細胞的成熟沒有顯著作用。

1 材料和方法

1.1 小鼠卵和胚胎的獲取和培養

健康、性成熟的ICR品系SPF (無特定病源)級小鼠購自昆明金殿動物中心。

超排方法:選擇處于間情期和發情前期的雌性小鼠, 腹腔注射PMSG(5 IU), 間隔46～48 h后腹腔注射hCG(5 IU), 隨即與雄鼠合籠, 翌日8:00 檢查陰栓, 有陰道栓者認為已完成交配行為。

胚胎的獲取和體外培養：取出輸卵管和子宮, 用消化或者沖洗的方法獲得胚胎, 在實體顯微鏡下檢查受精胚胎的發育階段。一細胞(兩原核期)胚胎培養在KSOM培養基中, 培養條件為37 ℃, 5% CO2。

GV(生發泡)卵的獲取：PMSG注射48 h后取出小鼠卵巢, 刺破卵泡獲得質量好的COCs, 用機械吹吸的方法去除顆粒細胞。GV卵在KSOM培養中進行成熟培養, 培養條件同上。

培養中使用的PTEN抑制劑bpV(pic)購自Calbiochem(Cat：203705).

1.2 免疫組化

體內獲取的不同發育階段的胚胎用PBS洗兩遍, 在3.7%中性多聚甲醛中固定15～20 min, 0.25% Triton-X100中透膜30 min, 1% BSA封閉至少1 h, 一抗4 ℃過夜, 二抗室溫1 h, Hoechst染核。在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

使用的一抗購自恩晶公司, PTEN(Ab-380/382/ 383)Antibody(cat：E021056), PTEN(Phospho-Ser380/ Thr382/Thr383)Antibody(cat：E11056)。100×稀釋。

1.3 統計分析

使用Excel軟件卡方檢驗進行統計分析,P＜0.05 定義為差異顯著。

2 結 果

2.1 PTEN蛋白在卵細胞和早期胚胎中的表達和分布

我們首先利用PTEN(Ab-380/382/383)抗體檢測了PTEN總蛋白在卵細胞和早期胚胎中的表達和定位, 繼而利用PTEN(Phospho-Ser380/Thr382/Thr383)抗體檢測了卵和胚胎中磷酸化的PTEN蛋白的表達和定位。這些位點上磷酸化的PTEN被認為是非活化形式(Salmena et al, 2008; Vazquez et al, 2001; Vazquez et al, 2000)。

對卵細胞及體內發育各階段的胚胎進行總PTEN和磷酸化PTEN免疫熒光染色, 結果如圖1(大寫A-F為磷酸化PTEN, 小寫a-f為PTEN總蛋白)。PTEN總蛋白在著床前各階段胚胎(圖1a-e)及卵細胞(圖1f)中都有表達, 主要分布在細胞核及近細胞膜上。磷酸化PTEN在一細胞、二細胞、四細胞及囊胚階段與PTEN總蛋白的分布基本一致, 但在致密化桑葚胚階段, 兩者呈現不同的分布：PTEN總蛋白同時分布在細胞核及卵裂球表面, 而磷酸化PTEN只分布在細胞核中。GV期卵細胞PTEN總蛋白和磷酸化PTEN也存在分布上的差異, 總蛋白分布在細胞核和近細胞膜上(圖1f), 而磷酸化PTEN則分布在細胞核中(圖1F)

2.2 PTEN在卵細胞成熟及早期胚胎發育中的作用

GV期卵細胞在成熟培養中, 加入不同濃度(0 μmol/L、 1 μmol/L、10 μmol/L)PTEN特異性抑制劑bpV, 觀察對生發泡破裂(Germinal vesicle breakdown, GVBD)的影響, 結果顯示，不加bpV(0 μmol/L)和加1 μmol/L、10 μmol/L bpV的GVBD率分別為86.4%和86.2%、84.6%, 無顯著差異(P＞0.05)。

取一細胞(兩原核期)胚胎在KSOM中培養, 培養基中添加0 μmol/L(對照)、2.5 μmol/L、5 μmol/L以及10 μmol/L濃度梯度的bpV, 每天觀察并記錄各組胚胎發育的情況。我們發現bpV的添加顯著抑制胚胎發育, 而且抑制的程度與濃度正相關。在濃度較低(2.5 μmol/L和5 μmol/L)時, 二細胞以后發育到每個階段的胚胎數都有所下降, 經過卡方檢驗, 2.5 μmol/L 和5 μmol/L兩組的四細胞、桑椹胚、 囊胚的發育率與對照組相比具都有顯著差異(P＜0.05)。在較高濃度(10 μmol/L)時沒有胚胎可以發育到囊胚, 幾乎所有胚胎的發育全部被抑制在二細胞時期(圖2)。

圖1 胚胎發育各階段以及GV卵的磷酸化PTEN和總PTEN的分布Fig. 1 Distribution of PTEN and phosphorylated-PTEN in pre-implantation embryos and GV oocytes

圖2 PTEN抑制劑bpV(pic)處理對早期胚胎發育的影響Fig. 2 Effect of pbV(pic) treatment on the developmental competence of early embryos

3 討 論

PI3K通路在小鼠胚胎發育中起重要作用, 在小鼠胚胎中, PI3K從一細胞胚胎到囊胚都持續表達并激活, PI3K和其磷酸化反應的產物PtdIns(3,4,5)P3都分布在細胞表面(Halet et al, 2008; Riley & Carayannopoulos, 2005)。敲除PI3K催化亞基或者抑制PI3K活性可引起早期胚胎致死(Bi et al, 2002; Halet et al, 2008)。PTEN是PtdIns(3,4,5)P3發生的負調控因子，所以在胚胎發育中很可能也有重要的作用。

我們的結果表明，PTEN在卵母細胞和早期胚胎發育中持續表達。利用PTEN特異性抑制劑bpV阻斷PTEN的活性, 可顯著影響早期胚胎發育潛能,其效果具劑量依賴性, 說明PTEN對早期胚胎發育具調控作用。PTEN總蛋白和磷酸化蛋白在桑葚胚階段卵分布不一致，活化的PTEN主要分布在裂球表面。該結果暗示PTEN可能在桑葚胚階段的致密化過程中起某種作用。低濃度的bpV并不能阻斷卵泡的成熟, 這與前人基因敲除的研究結果一致：在小鼠在初級卵泡中敲除PTEN不能影響卵母細胞成熟(Jagarlamudi et al, 2009)。

本實驗中使用的bpV最大濃度為10 μmol/L,本實驗證明該濃度對于體細胞和卵細胞都沒有毒性(Lai, 2007; Schmid et al, 2004; Li et al, 2010)。因此，在該濃度的bpV作用下觀察到的表型應該是PTEN活性抑制后產生的真實作用, 而不是細胞毒性的副產物。當然, PTEN對胚胎發育的作用還需通過mRNA表達的定量研究, 以及PTEN基因表達的干擾, 如RNA干擾或者基因敲除手段進行更為確鑿的驗證。抑制PTEN的功能, 一方面可破壞PI3K/AKT通路的平衡, 使AKT過度激活；另一方面也可降低信使分子PIP2的生成。PTEN對胚胎發育調控的詳細分子機制還需進一步的深入研究。

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Role of PTEN in mouse pre-implantation development

WANG Xi-Hong1,2,*, HE Xie-Chao1, HAN Shu-Biao1, JI Wei-Zhi1, ZHENG Ping1

(1. Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 2. Graduate School of the Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China)

The PI3K/Akt signal transduction pathway plays an important role in pre-implantation embryonic development. The tumor suppressor genePTENnegatively regulates the PI3K/Akt pathway. Although PI3K is constitutively activated during pre-implantation embryonic development, currently no evidence shows the presence and possible involvement of PTEN in early embryo development. We investigated the expression of PTEN protein in germinal vesicle (GV) stage oocytes as well as in pre-implantation embryos. The activated form of PTEN was distributed in the peripheral of GV oocytes and compact morula. Treatment of GV oocytes with PTEN inhibitor bpV(pic) did not affect the maturation of the oocyte, but significantly impaired embryonic development. Thus, our study suggests the necessary role of PTEN in pre-implantation embryonic development.

Oocyte; Pre-implantation embryonic development;PTEN; bpV

Q954.4; Q593.4; Q132.4

A

0254-5853-(2011)06-0647-04

10.3724/SP.J.1141.2011.06647

2011-06-16；接受日期：2011-08-15

?通訊作者(Corresponding author)，Tel/fax:+86-871-5198996, E-mail: wangxh06@post.kiz.ac.cn