長牡蠣基因組微衛星引物的開發和特性描述

韓斐斐，亓海剛，李莉，張國范，閆喜武，李慧娟，楊霏，王琳楠

（1. 大連海洋大學，遼寧 大連 116023；2. 中國科學院海洋研究所，山東 青島 266071）

長牡蠣基因組微衛星引物的開發和特性描述

韓斐斐1,2，亓海剛2，李莉2，張國范2，閆喜武1，李慧娟1,2，楊霏1，王琳楠1

（1. 大連海洋大學，遼寧 大連 116023；2. 中國科學院海洋研究所，山東 青島 266071）

長牡蠣于20世紀80年代從日本引進中國。在我國，長牡蠣已經成為重要的貝類養殖產業之一。本實驗從全基因組上篩查微衛星序列，在微衛星篩查的范圍、數目和類型上是傳統的富集文庫法開發微衛星所無法比擬的。利用基因組微衛星序列總共設計了104對引物，54對引物能擴增出目的片段，其中有34對引物顯示多態性擴增，占32.7%，20對引物顯示單態性擴增，占19.2%。在自然群體48個個體樣本中分析了這些位點的多態性，結果表明：等位基因數目在2～8之間，觀測雜合度和期望雜合度分別在0.065 2～0.795 5和0.063 8 ～0.853 4之間。34對微衛星分子標記中有7對符合哈迪－溫伯格平衡，27對或多或少的偏離平衡。微衛星分子標記可以用作分子遺傳育種、遺傳連鎖圖譜的構建、種群遺傳結構的分析、親緣關系分析等方面。

長牡蠣；微衛星；標記開發；基因組

長牡蠣（Crassostrea gigas）又稱太平洋牡蠣，屬于軟體動物門，瓣鰓綱，翼形亞綱，珍珠貝目，牡蠣科，具有個體大、生長速度快、適應性強、成活率高等特點[1]。20世紀80年代初從日本引入我國，80年代末在我國北部沿海大面積養殖，是我國海產貝類養殖中規模大、產量高的養殖品種之一[2]，也是世界上產量最高的養殖貝類品種之一[3]。我國牡蠣養殖產量在近 10年一直呈上升趨勢，長牡蠣的產量約占牡蠣總產量的1/3[4]。

微衛星（microsatellite）DNA，又稱短串聯重復序列（short tandem repeats，STRs）或簡單序列重復（simple sequence repeats，SSRs），是指由1～6 個核苷酸組成的簡單串聯重復DNA 序列，它是一種DNA長度多態性標記，并且具有多態性強，呈共顯性遺傳等特點。微衛星作為一種分子標記，已成為種群研究和進化生物學最常用的分子標記之一，廣泛地應用于生物雜交育種、遺傳連鎖圖譜、種群遺傳多樣性、系統發生等研究領域[5]。微衛星的特點主要體現在共顯性標記、多態信息含量高、結果穩定可靠。

李琪[6]等采用磁珠雜交選擇和PCR篩選法，從長牡蠣DNA選擇片段文庫中，分離含有微衛星序列的陽性克隆56個，其中41個（20.5%）有隨機側翼區，可以進行引物設計，還獲得兩個小衛星克隆。于紅[7]等從公共數據庫中4 201條長牡蠣EST開發10個微衛星標記，9個位點可以在C. plicatula和C. ariakensis中成功擴增。李莉[8]等研究了在一個回交家系中 15個微衛星的分離情況。Sekino[9]等通過長牡蠣微衛星富集文庫發現了123個包含引物設計區域的重復序列，設計了 9條分型引物，8個位點顯示多態性，并發現6、4、5個位點分別可以在C. sikamea, C. ariakensis, C. nippona中擴增獲得預期大小的等位基因。Huvet[10]等應用微衛星標記對長牡蠣和與之親緣關系很近的葡萄牙牡蠣 C.angulata進行了分析，為這2種牡蠣在自然群體中存在雜交現象提供了證據。Sauvage[11]等通過掃描9 272個長牡蠣EST－contigs設計22組微衛星分型引物，顯示 18個多態性位點。雖然長牡蠣中開發并應用微衛星引物有一系列相關報道，但在大規模開發微衛星標記上存在缺陷。

而大規模開發微衛星分子標記是推動長牡蠣分子遺傳學研究深入開展并走向應用的必要條件。本文所開發的微衛星標記來自 FOSMID大片段文庫的末端測序，在微衛星篩查的范圍、數目和類型上是傳統的富集文庫法開發微衛星所無法比擬的。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

Silvia[12]等在進行遺傳學分析時，發現群體的樣本容量要大于30。本實驗選用自然群體48個長牡蠣個體。

1.2 基因組DNA的提取

取長牡蠣肌肉，參照 Sambrook[13]等采用常規的酚/氯仿抽提的方法提取DNA。

1.3 微衛星序列的來源

實驗所用的序列來源為基因組測序時構建的大片段fosmid文庫末端測序，該文庫的基因組序列覆蓋度達到10倍，共完成451.164條fosmid－end測序，雙向成功reads數為225.582對，測序深度覆蓋整個基因組的0.17×，充分保證了在全基因組的層面上進行大規模的微衛星篩查。

1.4 引物的設計與合成

利用軟件RIMER PREMIER 5.0設計引物，引物長度在18～22 bp左右，GC含量在40%～60%之間，擴增目的片段長度在100～250 bp之間，在序列保守區內設計引物。總共設計了104對長牡蠣微衛星引物，由上海生工生物技術公司合成。

1.5 PCR擴增

PCR反應體系（15μl）：20 ng的基因組DNA、10×buffer緩沖液（20 mM Mg2+）、0.15 μl Tag酶、dNTP各0.2 mmol/L、引物各0.3 μmol/L。PCR反應條件：95℃變性5 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。各對引物的退火溫度見表1。用12%非變性聚丙烯酰胺（丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺體積比為29︰1）凝膠電泳分離PCR反應產物，電泳液為1×TBE緩沖液，電壓300 V，電泳1～2 h（北京六一儀器廠DYY-Ⅱ型電泳儀，DYCZ-30型電泳槽），Gel-red染色，利用UVP凝膠成像儀成像。

1.6 引物的篩選和數據處理

104對微衛星引物均先用長牡蠣自然群體的 6個DNA樣本擴增，能擴增出條帶的引物即被初選，然后初選的引物用自然群體的 48個個體擴增、跑跤。每對引物的電泳條帶按有條帶的記為 1，無條帶的記為 0，不同大小的條帶總數記為總等位基因數。

根據每個個體的條帶確定基因型，利用POPGENEGENE（VERSION 1.31）軟件統計微衛星基因座的等位基因數（Observed number of alleles，Na）、有效等位基因數（Effective number of alleles，Ne）、觀測雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）、遺傳相似系數（Genetic similarity index，I），群體間遺傳距離（Genetic Distance，Ds），并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。

參照Botstein 等[14]的方法計算多態性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）：

公式中，Pi、Pj分別為群體中第i和第j個等位基因頻率，n為等位基因數。

2 結 果

2.1 PCR擴增反應結果

本實驗總共設計了104對引物，其中有54對引物能在長牡蠣的6個樣本中擴增出目的片段。用長牡蠣自然群體的48個個體進行分析，34對引物顯示多態性擴增，占32.7%，20對引物顯示單態性擴增，占19.2%。

2.2 遺傳多態性分析

在長牡蠣自然群體的 48個個體樣本中分析了這些位點的多態性（圖1，圖2是T855-33引物分別在1～24和25～48個DNA樣本上的凝膠電泳圖）以T855-33引物為例，有等位基因7個，平均等位基因5.030 6，觀測雜合度0.520 8，期望雜合度0.809 6，并未偏離Hardy-Weinberg 平衡。

各位點分析如表1所示，結果表明：每個位點的等位基因數目在 2～8之間，平均等位基因數是5.0，觀測雜合度在0.065 2～0.795 5之間，期望雜合度在0.063 8～0.853 4之間。34對微衛星分子標記中有7對符合哈迪－溫伯格平衡，有27對或多或少的偏離平衡。

3 討 論

微衛星分子標記在分子遺傳育種、遺傳連鎖圖譜的構建、種群遺傳結構的分析、親緣關系分析等方面得到了廣泛的應用。目前開發微衛星分子標記的主要途徑有3種：一是整個基因組序列測序，檢索到微衛星序列，根據位點兩端序列設計引物；二是檢索基因組數據庫中已發表的序列，設計引物；三是利用SSR分子標記的可轉移性和通用性，在相近物種中篩選可用的引物。雖然傳統的富集文庫法開發微衛星分子標記的方法比較繁瑣，消耗大，但在未經過基因組測序的物種中，也常利用此方法開發微衛星分子標記。檢索基因組數據庫中已發表的序列開發微衛星標記，已有相關報道[7]。研究證明，利用微衛星引物的通用性，可以在相近物種中開發SSR分子標記，如李琪[15]等通過長牡蠣基因和EST序列開發 15個微衛星標記，發現這些微衛星至少可以在C. plicatula, C. hongkongensis, C. ariakensis,C. nippona和C. sikamea中的一種中擴增。對序列完全未知的物種可以利用微衛星標記的通用性來開發相近物種的SSR標記，可以提高研究效率。

實驗通過對整個基因組序列進行測序，采用新方法在全基因組上篩查微衛星序列，為大規模開發微衛星分子標記，從而推動長牡蠣分子遺傳學研究深入開展并走向應用提供必要條件。

表 1 34對多態性微衛星引物序列Tab. 1 Sequences of 34 novel polymorphic microsatellite loci for the Pacific Oyster Crassostrea gigas

續表1

表 2 34對多態性微衛星引物特性Tab. 2 Characterization of 34 novel polymorphic microsatellite loci for the Pacific Oyster Crassostrea gigas

致謝：中國科學院海洋研究所李娟、王家豐、王威對實驗的幫助，在此表示感謝。

[1] 李華琳. 長牡蠣苗種培育 [J]. 齊魯漁業, 2005, 22(10): 4-5.

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[3] FAO. 2008年世界漁業和水產養殖狀況 [R]. 羅馬: FAO, 2009.

[4] 于瑞海, 李琪, 王照萍, 等. 我國北方太平洋牡蠣育苗及養殖現狀 [J]. 科學養魚, 2008, (6): 3-5.

[5] Goldstein D B, Pollock D D. Launching microsatellites: a review of mutation processes and methods of phylogenetic interference [J].Hered, 1997, 88: 335-342.

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[7] 于紅, 李琪. 太平洋牡蠣養殖與野生群體遺傳變異的微衛星研究[J]. 遺傳學報, 2007, 34(12): 1114-1122.

[8] 李莉, 郭希明, 張國范. Inheritance of 15 microsatellites in the Pacific oyster Crassostrea gigas: segregation and null allele identification for linkage analysis [J]. 中國海洋與湖沼學報: 英文版, 2009, 27(1): 74-79.

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[11] Sauvage C, Boudry P, Lapegue S. Identification and characterization of 18 novel polymorphic microsatellite makers derived from expressed sequence tags in the Pacific oyster Crassostrea gigas [J].Molecular Ecology Resources, 2009, 9(3): 853-855.

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[13] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor [R]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

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Development and characterization of SSR in Genome for the Pacific Oyster Crassostrea gigas

HAN Fei-fei1,2, QI Hai-gang2, LI Li2, ZHANG Guo-fan2, YAN Xi-wu1, LI Hui-juan1,2,YANG Fei1, WANG Lin-nan1

(1. Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

The Pacific Oyster (Crassostrea gigas) was introduced into China from Japan in 1980s. Since then, the Pacific Oyster culture has been one of the important mollusks in China. Microsatellite (Simple Sequence Repeats,SSRs) sequences were screened from the whole genome, which has advantage over the traditional microsatellitescreening method including the scope, number and type of microsatellites. Primers were designed for one hundred and four SSR loci derived from genome microsatellite sequences. Fifty-four primer pairs amplified the target DNA fragments and 34 primer pairs were polymorphic in the Pacific Oyster, accounting for 51.9﹪ and 32.7﹪ of the total designed SSR loci. The polymorphisms of these loci were analyzed in 48 individuals from a natural population. The number of alleles per locus ranged from 2 to 8 with average of 5.0. The observed heterozygosity ranged from 0.0652 to 0.7955, and the expected heterozygosity ranged from 0.063 8 to 0.853 4. Seven of 34 microsatellite markers accord with Hardy-Weinberg equilibrium (HWE), and 27 markers show more or less bias from HWE. These SSRs can be used in inheritance cross-breeding, linkage genetic mapping, and other domains in the species.

Crassostrea gigas; Microsatellite; Marker development; Genome

Q751

A

1001-6932(2011)05-0566-06

2011-03-11；

2011-05-11

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃項目，2010CB126402）；國家自然基金（40730845）；國家公益性行業(農業)科研專項（3-53）；中國博士后基金（20090461270）。

韓斐斐（1984－），女，碩士研究生，從事水產養殖分子生物學研究。電子郵箱：hanfeifei0325310406@126.com。

閆喜武，教授。電子郵箱：yanxiwu2002@163.com。