fSSR分析技術的建立及在大黃魚（Larimichthys crocea）親子鑒定中的應用

武祥偉，劉賢德，王志勇

（集美大學 水產學院 農業部東海海水健康養殖重點實驗室，福建 廈門 361021）

fSSR分析技術的建立及在大黃魚（Larimichthys crocea）親子鑒定中的應用

武祥偉，劉賢德，王志勇

（集美大學 水產學院 農業部東海海水健康養殖重點實驗室，福建 廈門 361021）

以大黃魚（Larimichthys crocea）為材料，對熒光標記微衛星（fSSR）分析體系進行了優化，建立了適合大黃魚fSSR分析的最佳條件。與常規的銀染法相比，該方法成本略高，但其分辨率高，可重復性強，檢測效率為銀染法的6～10倍。利用優化的fSSR技術進行了大黃魚親子鑒定的研究，結果顯示在使用6對引物的情況下，大黃魚兩個群的親子鑒定率超過99%。

fSSR；大黃魚；親子鑒定；Gel-Scan 3000

微衛星（microsatellite），又稱簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR），是當前應用較為廣泛的 DNA分子標記之一[1]。微衛星檢測的方法有多種，如同位素法[2]、銀染法[3]、測序法[4]、熒光標記法[5]。目前大部分實驗室都采用銀染法，此方法具有操作簡便、無同位素污染等優點，但需時較長，慢速銀染法需要2～3 h，快速銀染法也在半小時以上。熒光標記微衛星（fSSR）檢測技術是近年來發展的一項新技術，其基本原理是在一條或兩條引物的5’端標記一種熒光素，如HEX，FAM等，用此種引物進行PCR擴增，產物在聚丙烯酰胺凝膠上分離，在電泳過程中熒光素經激光照射激發出熒光被捕捉到而成像。此種方法無需銀染顯色，分析效率較高。但目前尚未見使用 fSSR方法對大黃魚進行分析的報道。

本研究使用Gel-Scan 3000激光掃描電泳系統，對 SSR反應中多個因子進行優化，建立了大黃魚fSSR分析體系，并使用優化的fSSR技術對2個群的大黃魚進行了親子鑒定，以驗證該體系的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 fSSR體系建立材料 2009年采自福建省寧德市官井洋海區的養殖大黃魚，剪取部分鰭條，保存于75 %乙醇，用于DNA抽提。大黃魚SSR引物[6,7]，由上海英駿生物工程公司合成，上游引物5’端標記熒光素HEX（表1）。

1.1.2 親子鑒定材料 所用材料取自福建省寧德市大黃魚養殖基地，由集美大學大黃魚品種選育課題組提供。2007年3月，從經過室內升溫強化培育的候選親本群體中挑選7雌8雄共15尾性狀優良、體質健壯、成熟度較好的個體，采用大黃魚常規育苗生產中所用的“人工催產、隨機交配”繁育措施建立了2個窩選群體，分別包含4♀×4♂（1#群），3♀×4♂（3#群）。親魚產卵結束后收集受精卵，室內孵化并于1個月后轉移至海區網箱養殖。親本剪取部分背鰭保存，備用。2008年10月分別從2群子代（20月齡）中分別隨機選取279尾和315尾，剪取部分背鰭。以上樣本固定于75%的酒精中，用于下一步的DNA提取和親子鑒定分析。

表1 大黃魚SSR引物信息Tab. 1 SSR primers information of larger yellow croaker

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提 采用傳統酚-氯仿法提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，并將濃度調整至30 μg/mL，置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 SSR分析 對影響 PCR反應的主要因子設置梯度進行單因素優化分析，優化時每梯度使用2尾大黃魚樣品。PCR在ABI thermal cycler（美國ABI公司）上進行，初始反應體系參考任鵬等[7]的報道。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 Gelscan 3000電泳程序：PCR產物中加入1/6體積的6×Loading Buffer（98%去離子甲酰胺，1.75% 10 mmol/L EDTA，0.25%溴酚藍），95℃變性5 min后迅速置于冰上，取1 μL于5%變性聚丙烯酰胺凝膠（19：1）上電泳。以 GenScanTM-500 TAMRATM Size Standard作為分子量標準，電泳完畢后保存掃描圖像，并使用ONE DScan software分析統計數據。

Bio-Rad電泳程序：聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染程序參照王志勇等使用的方法[8]進行。

1.2.4 親子鑒定分析 使用Cervus 3.0軟件中鑒定效率最高的NE-PP模型作為分析模式[9,10]，首先根據親本基因頻率進行模擬分析，之后依據子代基因型進行親子鑒定分析。

2 結 果

2.1 影響大黃魚fSSR體系的因素

2.1.1 模板濃度 7個DNA濃度：5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、30 ng、50 ng、60 ng，電泳結果（圖1）顯示各濃度均能擴增出清晰目的帶，從體系穩定性與經濟角度考慮，本文選擇10 ng的DNA濃度。

2.1.2 引物濃度 6個引物濃度梯度：0.08 μmol/L、0.1 μmol/L、0.15 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.35 μmol/L的電泳圖譜（圖2）顯示后2個濃度擴增較好。基于降低成本考慮，引物濃度為0.3 μmol/L較合適。

圖1 DNA濃度對fSSR擴增的影響Fig.1 Effect of template concentration on fSSR reaction

圖2 引物濃度對fSSR擴增的影響Fig. 2 Effect of primer concentration on fSSR reaction

2.1.3 Mg2+濃度 7個 Mg2+濃度 1 mmol/L、1.2 mmol/L、1.5 mmol/L、1.8 mmol/L、2.0 mmol/L、2.3 mmol/L、2.5 mmol/L電泳圖譜（圖3）顯示濃度過高出現非特異擴增，Mg2+為1.2 mmol/L目的帶亮度合適。

圖3 Mg2+濃度對fSSR擴增的影響Fig. 3 Effect of Mg2+ concentration on fSSR reaction

2.1.4 Taq DNA聚合酶濃度 7個Taq DNA聚合酶濃度 0.2 U、0.5 U、0.7 U、1 U、1.2 U、1.5 U、2 U電泳圖譜（圖4）表明 Taq DNA聚合酶量過高易引起非特異性擴增，0.2 U的Taq DNA聚合酶量是經濟的選擇。

圖4 Taq DNA聚合酶濃度對fSSR擴增的影響Fig. 4 Effect of Taq DNA polymerase concentration on fSSR reaction

2.1.5 PCR循環次數 本文設置20循環、25循環、30循環、35循環、40循環5個循環次數梯度。電泳顯示，循環數少，檢測不到目的帶，從擴增條帶的清晰度、特異性方面考慮，適合的循環擴增次數應不少于30循環（圖5）。

2.1.6 PCR體系體積 本文設置3個反應體系體積：5 μL、10 μL、15 μL。電泳圖譜（圖 6）顯示 3組間無明顯差異，均能擴增出穩定清晰的電泳條帶，基于穩定性和成本考慮，本研究選擇10 μl體系。?

圖5 PCR循環次數對fSSR擴增的影響Fig. 5 Effect of the number of PCR cyclers on fSSR reaction

圖6 PCR體系體積對fSRR擴增的影響Fig. 6 Effect of PCR total volume on fSSR reaction

2.1.7 fSRR體系的建立 依據上述確立的條件，本文建立了一套基于Gel-Scan 3000實時激光掃描電泳系統的大黃魚fSSR分析體系（表2），并結合實際應用進行了微調。

PCR程序：95 ℃ 5 min；33個循環包括94 ℃30 s，退火溫度 30 s，72 ℃ 50 s；保溫 72 ℃ 15 min。

表2 大黃魚fSSR反應體系Tab. 2 fSSR reaction system for large yellow croaker

2.1.8 fSSR體系穩定性檢測 使用12尾養殖大黃魚樣品與3個大黃魚SSR位點（表1）檢測fSSR體系的穩定性。電泳圖譜顯示目的條帶清晰整齊，重復性強（圖7），3個位點分別檢測到24、23、22個目的條帶。

圖7 基于Gel-Scan 3000的3個SSR位點電泳圖譜Fig. 7 Electrophoresis pattern of three microsatellite markers based on Gel-Scan 3000（A： LYC0002, B： LYC0004, C： LYC0066）

2.2 普通聚丙烯酰胺凝膠電泳

使用普通PCR擴增體系[7]與銀染方法，對上述樣品與微衛星位點進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，3個SSR位點（未標記HEX）在12尾大黃魚中分別檢測到23、21、20個目的條帶（圖8）。

圖8 3個SSR位點的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig. 8 Polyacylamide gel electrophoresis profile of three microsatellite loci（A： LYC0002, B： LYC0004, C： LYC0066）

2.3 fSSR在大黃魚親子鑒定中的應用

本文6對SSR引物（表1），使用本文所建立的方法，對 1#和 3#大黃魚群體進行了親子鑒定研究，結果在95%置信度下，1#和3#群的鑒定率均在99%（表 3）以上，顯示該方法具有較好的鑒定效果。

表3 2個群的大黃魚鑒定結果Tab. 3 Parentage results for two batches of large yellow croaker

3 討 論

3.1 fSSR體系的建立

fSSR體系中，模板的用量是首要影響因素，其用量的多少直接影響到 PCR擴增結果[11]，因此本研究首先設置了范圍較廣的模板濃度梯度進行優化試驗。其次，Mg2+及Taq聚合酶濃度對熒光標記微衛星分析體系的影響較大，濃度過高將產生非特異性擴增。引物用量或循環次數過低將導致擴增產物量少，電泳條帶暗淡；一般認為引物與模板的比例至少為108︰1才能保證PCR過程中引物與模板退火，而不是模板自身退火[12]；由于不同微衛星引物的擴增效率及擴增特異性有差別，故較難準確把握PCR循環次數，通常30次循環比較合適；但由于熒光標記微衛星引物的價格高于普通引物，所以可采用小范圍提高循環次數，減少引物量來降低成本，因此本文使用33個PCR循環。此外減小PCR體系體積也是降低成本的一種策略，但體積過小，一方面可能造成樣本間試劑加入量不均等，擴增效果不均一，另一方面由于水分蒸發，體系中干擾物的影響變得明顯，擴增效果不理想，本實驗室在進行SSR分析時也證明了此點，因此本文采用10 μL體系。

3.2 熒光法與銀染法檢測效率與成本的比較

早期的DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳是應用放射性核素標記完成的，但該方法操作不便，而且可使用范圍局限于少數具有放射性核素設施的單位；其后主要使用銀染法，該方法克服了放射性核素標記法的缺點，但銀染法不僅耗時較長，顯色效果有時較難把握，而且，由于正、反單鏈以及未解離的雙鏈都能被染色，常導致一個等位基因產生多個銀染條帶，當等位基因之間差異較小時，常常與之相混雜，難以區分是來自同一個等位基因的重復條帶，或者來自不同等位基因的條帶。而且銀染法需從膠板人工讀取數據，工作繁瑣，受人的主觀性與誤判影響導致的誤差大。熒光法不僅可以使用計算機軟件統計數據，自動讀出等位基因大小，而且它僅標記PCR產物的單鏈、不帶標記的反向單鏈不會被檢出，1個等位基因電泳分析結果通常只顯示唯一一條清亮的條帶，彌補了銀染法等存在的上述不足，是微衛星檢測技術未來的發展方向之一[13]。正因為如此，本研究使用12尾大黃魚樣品與3個微衛星位點，熒光法較銀染法分別多檢測到1、2、2個目的條帶。

本研究中銀染法與熒光法完成70個SSR反應分別需費用為18.7元和19.5元，熒光法成本稍高，但銀染法需多一步銀染過程，銀染之后需人工讀取數據，效率較低。因此，考慮到時間成本和人工成本，本文建立的熒光法檢測效率是銀染法的 6～10倍，是一種更經濟的分析方法。此外，熒光法費用較高的原因在于熒光素標記的引物是普通引物價格的 10倍左右，且不宜長期保存。因此，當需分析大量的微衛星位點時，可以考慮通過采用標記通用引物法降低成本[14]。

3.3 fSSR方法的應用

微衛星標記具有在基因組中數量多、分布較均勻、共顯性遺傳、多態性高以及PCR擴增穩定可靠等優點，已應用在水產生物眾多研究領域。微衛星標記應用的前提是開發出多態性高的微衛星位點。在大黃魚微衛星位點的開發研究方面，林能鋒等[15]使用 PCR法篩選大黃魚部分基因組文庫，得到 2對穩定擴增的大黃魚引物；Guo等[6]、 An等[16]與Chang等[17]則使用FIASCO法分別篩選出11對、6對與 11對多態性較高的大黃魚微衛星位點；郝君等[18]采用生物素-磁珠富集方法篩選出30對大黃魚微衛星位點；丁少雄等[19]使用6對眼斑擬石首魚的微衛星引物成功在大黃魚中進行了跨種擴增。多態性較高的微衛星標記已應用在水產生物的遺傳結構及遺傳多樣性分析[20]、遺傳連鎖圖譜構建[21]、分子標記輔助育種[22]以及預測有效群體大小及群體波動[23]等研究領域。

微衛星標記在水產動物親子鑒定研究中也有較多的應用。在斑節對蝦（Penaeus monodon）中，Jerry等[24]使用 7個多態性較高的微衛星位點成功鑒別出來自 13個家系的個體的親緣關系；Neff[25]使用11個微衛星位點對美國Opinicon湖中幾個藍腮太陽魚（Lepomis macrochirus）群體后代的系譜關系進行了鑒定；Bentzen等[26]使用多重微衛星PCR方法對 14個親本的 135尾大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）成功進行了系譜關系分析與追蹤；Rodzen等[27]使用微衛星標記分析了157尾高首鱘（Acipenser transmontanus）的親緣關系，鑒定率超過99%。本文使用6對SSR引物，利用本文建立的fSSR技術對2個大黃魚混合交配群進行親子鑒定分析，鑒定率均超過99%，不僅證明了該技術在大黃魚系譜追蹤上的可行性，而且為將來更準確進行大黃魚遺傳連鎖圖譜構建、分子標記輔助育種、種質資源保護等研究奠定了基礎。

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Condition exploration and optimization for fSSR system and its application in large yellow croaker Larimichthys crocea for parentage assignment

WU Xiang-wei, LIU Xian-de, WANG Zhi-yong

(Key Laboratory of Healthy Mariculture for East China Sea, Ministry of Agriculture of China, Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China)

In this study, the fluorescent labeling microsatellite (fSSR) analysis system was constructed and optimized in larger yellow croaker Larimichthys crocea. Although the cost of the fluorescent method was a little higher than that of the silver-staining method, it was 6～10 times efficient compared with the latter with high resolution and repetition .Furthermore, the parentage assignment rates for two groups of large yellow croaker were both more than 99% using optimized fSSR with six microsatellite loci, which means this technology is very usefull.

fSSR; Larimichthys crocea; paretage assignment; Gel-Scan 3000

Q178.53

A

1001-6932(2011)04-0419-06

2010-11-25；

2011-03-12

公益性行業（農業）科研專項(200903029-4)；國家自然科學基金項目(30771663)；集美大學優秀青年骨干教師基金（2009C002）。

武祥偉 ( 1984－ )，男，碩士研究生，主要從事水產動物遺傳育種研究。電子郵箱：wxw9559@gmail.com。

王志勇，教授。電子郵箱：zywang@jmu.edu.cn。