解整合素-金屬蛋白酶9在非酒精性脂肪肝小鼠中表達

張勇勇 李三強 程維剛 李記天

(1河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院)分子與生物學實驗室，河南 鄭州 450000；2河南科技大學基礎醫學院肝臟損傷與修復分子醫學重點實驗室；3河南省肝病防治工程技術研究中心；4河南科技大學第一附屬醫院)

隨著生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝(NAFLD)患病率逐年上升，嚴重影響人們的身心健康〔1〕。NAFLD可以逐漸進展為肝纖維化、肝硬化及肝癌，是全球公認的第一大慢性肝病，但其發生發展的分子機制尚不完全清楚〔2〕。解整合素-金屬蛋白酶(ADAM)9是近年來研究最熱的ADAMs家族成員之一，在肝癌的發生、發展和轉移過程中發揮重要作用〔3〕。ADAM9在酒精性肝損傷過程中有促進肝損傷的作用，但其在NAFLD中的作用尚不清楚。本研究采用高脂飼料喂養誘導小鼠NAFLD研究ADAM9的表達變化，探討ADAM9在NAFLD中的作用。

1 材料方法

1.1動物與材料 健康SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體重(20±2)g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供。動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001。試劑：谷草轉氨酶(AST)檢測試劑盒(浙江伊利康生物科技有限公司)；抗ADAM9單克隆抗體(美國圣克魯斯生物技術公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；高脂飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)；二氨基聯苯胺(DAB，上海百賽生物科技有限公司)。儀器：日立7180全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.2模型制備〔4〕選用雄性C57BL/6小鼠40只，適應性飼養2 w后，隨機分為正常組(10只)和模型組(30只)。模型組小鼠飼喂含60%脂肪的飼料，共12 w，誘導小鼠NAFLD，正常組給予常規飼料喂養。模型組分別于飼養4、8和12 w末各取10只小鼠分別為高脂飼養4 w、8 w、12 w組，各組按相應時間進行眼球取血制備血清，然后頸椎脫臼處死并分離肝組織。

1.3血清AST活性檢測〔5〕用全自動生化分析儀檢測血清中AST的活性。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色檢測肝組織病理變化〔6〕分離小鼠肝組織固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片機4 μm厚度連續切片，常規HE染色。肝細胞壞死積分統計方法：顯微鏡下觀察組織壞死情況，0分為未見壞死；1分為<2處壞死；2分為2～3處壞死；3分>3處壞死；4分為大片壞死區域。每組隨機挑選10張HE染色圖片，計算壞死積分，進行統計分析。

1.5免疫組化檢測肝組織ADAM9蛋白表達水平〔7〕小鼠肝組織常規石蠟切片，按照免疫組化試劑盒說明書步驟進行操作，ADAM9抗體(1∶300稀釋)4℃過夜，二抗孵育，DAB顯色。利用Image Pro Plus6.0軟件對每只小鼠肝臟切片至少12 mm2的區域進行組織測量，并進行半定量分析。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組血清AST活性表達變化 與正常組〔(105±13)U/L〕相比，高脂飼養4 w組AST活性〔(206±21)U/L〕明顯升高(P<0.05)，高脂飼養8、12 w組AST活性〔(317±29)、(446±31)U/L〕進一步升高(P<0.01)。說明高脂飼養誘導小鼠肝損傷且損傷程度呈時間依賴性。

2.2各組肝組織HE染色 高脂飼養4 w組肝組織開始出現壞死，壞死積分〔(1.25±0.05)分〕顯著高于正常組〔(0.02±0.01)分；P<0.05〕；高脂飼養8、12 w組肝組織中出現大片壞死，壞死積分〔(2.50±0.26)、(13.60±0.37)分〕進一步升高，且呈時間依賴性(P<0.01)。見圖1。

圖1 各組不同時間點肝臟HE染色(×200)

2.3各組肝組織ADAM9表達 與正常組(1.2±0.07)比較，高脂飼養4 w組肝組織中ADAM9陽性細胞表達量(12.3±1.23)顯著升高(P<0.05)，高脂飼養8 w組肝組織中ADAM9陽性細胞表達量(43.6±3.56)達到頂峰且顯著高于高脂飼養4 w組(P<0.01)，高脂飼養12 w組表達量(27.2±4.21)較高脂飼養8 w組明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 免疫組織化檢測各組不同時間點肝組織 ADAM9表達(×200)

3 討 論

ADAM9是ADAMs家族的重要成員，具有細胞黏附和蛋白水解的功能，能夠調控細胞膜表面的生長因子和受體的活性，有利于腫瘤轉移〔8,9〕。各種不同病因的慢性肝疾病研究發現，活化肝星形細胞中ADAM9mRNA表達水平顯著高于靜止期肝星形細胞，推測ADAM9在多種肝纖維化疾病細胞外基質重塑過程中發揮重要作用〔10〕。孫海寬等〔11〕通過采用CRISPR/Cas9技術研究肝組織ADAM9基因表達變化時發現，ADAM9可抑制急性酒精性肝損傷小鼠中肝細胞的增殖。有研究同樣發現〔12〕，在小鼠急性酒精性肝損傷過程中，ADAM9的表達呈現先升高后降低的趨勢，提示其在肝損傷和修復過程中發揮重要作用。

本研究結果表明，高脂飼料喂養小鼠可以成功誘導肝損傷，ADAM9表達量在此過程中變化顯著。AST主要分布于肝細胞的線粒體內，在肝細胞受損嚴重累及線粒體時被釋放入血中，是反映肝細胞損傷的良好因子；HE染色可以直接觀察肝組織損傷壞死情況，二者結合準確地反映了該研究造模成功。ADAM9表達量與正常組相比開始升高，達到頂峰后出現下降，這可能與肝損傷后出現的修復現象有關。

綜上，ADAM9與NAFLD的發生發展密切相關，可能在此過程中起到了促進肝損傷的作用。