拼接式毛細管電泳柱后蛋白質熒光衍生微膜反應器的構建與性能研究

張凌怡等

摘 要 通過將兩根柱端刻蝕的毛細管插入一小段聚砜中空纖維膜中，兩根毛細管在膜內距離為零，構建了拼接式毛細管電泳柱后蛋白質熒光衍生微膜反應器，研究了其衍生化性能。拼接式微膜反應器中，衍生試劑通過兩根拼接毛細管之間的空隙進入反應池和目標物反應。研究表明，與膜長0.3～1.0 mm非拼接式微膜反應器相比，拼接式柱后衍生微膜反應器可保證衍生化試劑和分析物充分反應，有效改善柱效和檢測靈敏度。考察了分離電壓（5～10 kV）及衍生試劑濃度等因素對衍生化反應的影響，并對熒光強度和蛋白質樣品濃度之間的關系進行了探究。當運行電壓為10 kV， 衍生試劑為含有1.5 mmol/L 2，3-萘二甲醛和 60.0 mmol/L β-巰基乙醇的100 mmol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 9.5）時，在0.007～0.04 mg/mL濃度范圍內，熒光強度與蛋白質濃度之間具有良好的線性關系，對標準蛋白BSA的檢出限可達5.6 nmol/L。與毛細管區帶電泳/紫外檢測結果對比，此反應器幾乎沒有增加系統的死體積，柱效也無明顯降低，具有良好的穩定性和重現性。

關鍵詞 拼接式微膜反應器； 毛細管電泳； 柱后熒光衍生； 蛋白質

1 引 言

毛細管電泳（CE）因其具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、容易實現自動化等優點，在生物樣品的分離分析方面發揮著重要作用[1～4]。但CE的檢測光程一般較短， 采用紫外檢測靈敏度較低， 在一定程度上限制了其應用。激光誘導熒光檢測器 （LIFD） 以激光器為光源，更易于聚焦至微分析系統的流通光路中，是CE中靈敏度最高的一種檢測器[5，6]。高靈敏度的LIFD與高分辨率的CE分離技術相結合， 不僅可以提高檢測靈敏度，還可改善選擇性，在生物樣品方面具有廣闊的應用前景[7]。

目前， 已知的蛋白質大部分沒有自然熒光[8]，使用熒光檢測時通常需對蛋白質進行熒光衍生。文獻報道的蛋白質熒光衍生化法主要有柱前衍生、柱上衍生、柱后衍生3種類型[9，10]。柱前衍生是最常用的衍生化方式，其衍生化過程和分離過程分別獨立完成，樣品經衍生化后被送入分離系統進行分離分析，對衍生化產物的穩定性要求較高[11，12]。柱上衍生為衍生過程和分離過程同時進行的衍生化方法，緩沖液必須同時滿足衍生化和分離的需求[13，14]。無論柱前衍生還是柱上衍生，其衍生化過程都會帶入較多的雜質而影響檢測結果。柱后衍生法中， 樣品經CE分離后再與衍生化試劑發生反應，可避免雜質及多重衍生峰對分離結果的影響，因此特別適合像蛋白質這種復雜且具有多反應位點的大分子的熒光衍生。

柱后衍生反應器的制作是柱后衍生的難點之一，目前文獻報道的柱后衍生反應器主要有間隙式、同軸式和鞘流式等 ＼[9]。間隙式柱后衍生反應器因其結構簡單，已被大量應用于CE-LIFD系統中，然而即使擴散系數較小的大分子樣品也會在間隙處產生損失，準直性問題造成的擴散損失也不容忽視。中空纖維膜具有良好的尺寸排阻特性，可以減少蛋白質在接口處的擴散損失，并且可以避免普通間隙式反應器接口處因準直性差造成的樣品擴散損失。

在本研究組的前期工作中[15，16]，利用膜的半滲透性，使用截留分子量小于蛋白質分子量的中空纖維膜構建了一種新型柱后衍生微膜反應器，并應用于蛋白質的CE-LIFD檢測，取得了較好的效果。然而，將配有柱后衍生微膜反應器的毛細管區帶電泳（CZE）系統與一般的CZE比較發現，前者死時間增加15%，柱效也有所下降，說明反應器帶來較大死體積 ＼[15]。為了完善該反應器，本研究構建了死體積較小的拼接式柱后熒光衍生微膜反應器，并對其性能進行了研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

熔融石英毛細管 （75 μm i.d.375 μm o.d.，邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司）；中空纖維膜 （MWCO 10000 Da， 200 μm i.d.220 μm o.d.，中科院大連化學物理研究所）；高壓直流電源（天津東文高壓電源有限公司）。2，3-萘二甲醛 （NDA，北京百靈威科技有限公司）； β-巰基乙醇 （β-ME，上海阿拉丁試劑有限公司）；牛血清白蛋白第5組分 （BSA）和胎球蛋白（Fetuin）（美國Sigma-Aldrich公司）；其它試劑均為分析或更高純度試劑；實驗用水經 Sartorius Arium 611 （德國Sartorius公司） 純水儀純化。

2.2 溶液的配制

分別配制1 mg/mL的 BSA和Fetuin標準儲備液，4℃保存，再用水逐級稀釋至所需濃度。

硼酸鹽緩溶液是由硼砂配制而成，并用1 mol/L NaOH溶液調至pH 9.50；磷酸鹽緩沖液是由NaHPO4配制而成，并用1 mol/L NaOH溶液調至pH 11.00；NDA和β-ME溶于甲醇中，作為母液備用；衍生反應溶液：100 mmol/L硼酸鹽緩沖液中 （pH 9.5） 加入適量 1.5 mmol/L NDA和 60 mmol/L β-ME的甲醇溶液；最終的分離緩沖溶液是由磷酸鹽緩沖液加入0.4% （m/V） PEG 8000和10% （V/V） 乙腈 （ACN） 組成。上述溶液在使用前用0.22 μm有機微孔濾膜過濾。

2.3 柱后衍生微膜反應器的構建[15]

將兩根柱端刻蝕的毛細管插入一小段聚砜中空纖維膜中，使兩根毛細管在膜內相距0～1 mm，然后用環氧膠固定；再將固定有纖維膜的這一段毛細管固定在用以盛裝衍生試劑的反應池中；最后在檢測毛細管上接近反應池的一端除去一小段聚酰亞胺涂層作為檢測窗口。圖1為微膜反應器的衍生原理示意圖。

2.4 實驗條件

自行搭建的共軸型結構激光誘導熒光檢測器的激發波長和發射波長分別為473和525 nm； 分離毛細管的入口端放入分離緩沖液容器中，電極接正極；檢測毛細管的出口端置于廢液容器中，電極接地。為減少外界雜散光的影響，整個系統置于暗箱中。

每天使用前，膜反應器用0.1 mol/L HCl、超純水、0.1 mol/L NaOH、超純水依次沖洗5 min。每5次進樣后用0.1 mol/L NaOH、超純水、分離緩沖液按照出峰的保留情況依次沖洗2～5 min。除特定指出外，電泳分離分析均在200 V/cm電壓下進行，200 V/cm電進樣10 s。

3 結果與討論

3.1 膜長與熒光強度的關系

前期工作[15，16]中發現，1 mm膜長反應器死體積較大，本研究構建了膜長約為1.0 mm微膜反應器，并考察了膜長與熒光強度的關系，構建了拼接式微膜反應器（衍生試劑通過兩根拼接毛細管之間的空隙進入反應池和目標物反應），并詳細研究了其性能特征。圖2是毛細管電泳激光誘導熒光檢測系統的結構示意圖。

以0.1 mg/mL BSA為樣品，研究～1.0 mm膜長與熒光強度的關系，結果如圖3所示。在相同實驗條件下，熒光強度隨著膜長度的增加而降低，并且峰型稍有展寬，柱效降低。表明兩根毛細管之間的間隙已足夠使得衍生試劑和待測目標物充分反應。因此，采用拼接的方式，結合膜的阻隔作用，可以更好地實現蛋白質的柱后衍生及熒光檢測，避免過長的膜導致的較大死體積。

3.2 運行電壓的影響

在拼接式微膜反應器系統中，運行電壓通過影響電滲流速度而影響樣品的衍生化反應時間，進而影響檢測。運行電壓過大，電滲流速度太大，導致膜內外溶液交換時間短，衍生試劑進入膜內量少，衍生反應不完全。同時， 運行電壓過大，焦耳熱效應對膜的損害也很大。圖4為運行電壓5～10 kV 時，0.1 mg/mL BSA衍生化產物熒光信號及保留時間的變化趨勢。隨著運行電壓的減小，熒光強度呈略微增大趨勢，但保留時間大大延長，導致分析周期過長。綜合考慮兩種因素，采用10 kV為運行電壓。采用高于10 kV的運行電壓可以加快分析時間，但是在所構建的系統中，焦耳熱現象已經十分明顯。

3.3 衍生試劑濃度的影響

NDA與β-ME反應的產物與氨基反應速度快，熒光量子產率高，已經被大量用于CE柱后衍生化系統。在前期工作[15，16]中已經對NDA、β-ME及蛋白質的最佳配比加以優化。但在拼接式柱后衍生CE-LIFD系統中，衍生化區段長度大大減小，相同條件下進入膜內的衍生化試劑量也相應地減少，因此，考察衍生試劑濃度對衍生化程度的影響十分必要。以0.1 mg/mL BSA為樣品，分別考察不同衍生化試劑濃度對衍生化反應的影響，結果如圖5所示。

由圖 5 可見，隨著衍生化試劑濃度的增加，BSA的熒光強度幾乎沒有變化，說明當衍生試劑的組成是100 mmol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 9.5）中含

3.4 熒光強度與蛋白質濃度間關系

如圖6所示，當BSA濃度在0.007～0.04 mg/mL時，蛋白質濃度與熒光強度有良好的線性關系，線性回歸方程為y=106.27x-0.5206 （R=0.9996）。以實驗中基線峰值為噪聲（0.012 mV）， 測得BSA 的檢出限為0.34 μg/mL （S/N=3），即5.6 nmol/L。此結果與文獻＼[17＼]報道的鞘流式柱后衍生反應器（8.6 nmol/L）處于同一數量級。圖7為0.007 mg/mL BSA的電泳譜圖。

3.5 系統死體積與柱效間關系

使用與拼接式柱后衍生微膜反應器具有相同內徑、相同檢測長度和相同總長度的空管柱作對照，使兩者在相同條件下對相同濃度的BSA樣品進行CZE分析，考察膜反應器對系統死體積及柱效的影響。實驗中膜反應器的反應池內充滿分離緩沖液。

相比于常規空管柱CZE分析，拼接式柱后衍生微膜反應器系統中的死時間和空管柱的死時間幾乎相同， BSA峰寬說明柱效沒有明顯降低，相對于1 mm膜長反應器的CZE分析結果，分析系統的死體積大大降低，系統柱效得到顯著提高。

3.6 分離能力和穩定性考察

用該微膜系統分離標準蛋白質BSA和Fetuin的混合物，結果如圖8所示。兩者分離度R=3.07，柱效分別為 1387和1285塔板數/m。

進一步對該系統的重復性及穩定性進行考察。連續進樣3次， BSA和Fetuin保留時間的RSD分別為0.6%和0.3%；峰高的RSD分別為4.6%和3.2%。在連續進行35次后，微膜反應器依舊穩定，分離能力和柱效沒有顯著變化，說明其穩定性良好。

4 結 論

構建了拼接式毛細管電泳柱后蛋白質熒光衍生分離檢測系統，考察了分離電壓及衍生化試劑濃度等因素對衍生反應的影響，BSA濃度在0.007～0.04 mg/mL濃度范圍內，熒光強度和樣品濃度呈良好的線性關， BSA的檢出限可達5.6 nmol/L。此反應器死體積較小，具有良好的穩定性和重現性。本研究為進一步將拼接式柱后衍生微膜反應器應用于復雜蛋白質樣品的分離分析提供參考。

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