擬南芥Rad23原核重組蛋白構(gòu)建和活性檢測

摘 要：在擬南芥中，Rad23基因通過參與泛素/26S蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和激素應(yīng)答.為進(jìn)一步研究該基因編碼蛋白的分子作用機(jī)制及其生物學(xué)功能，構(gòu)建了pCold-Rad23融合蛋白重組表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果表明，分子質(zhì)量為94 ku左右的融合重組蛋白在大腸桿菌中獲得高效表達(dá).采用純化的重組蛋白多次免疫昆明小白鼠的方法，獲得了特異性強(qiáng)并且效價(jià)高的多克隆抗體，經(jīng)蛋白印跡檢測，在分子質(zhì)量40 ku左右處出現(xiàn)特異的蛋白質(zhì)條帶，證明所制備的抗血清可以與擬南芥Rad23蛋白特異性結(jié)合.

關(guān)鍵詞：蛋白；泛素/26S蛋白酶體；原核表達(dá)；抗體

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中圖分類號：Q511 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Purification of Arabidopsis Rad23 Recombinant 

Protein in Engineering Bacteria

and Preparation of Its Polyclonal Antibody

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LI Xiu-shan， LIU Bin， ZHAO Li-jian， TANG Dong-ying，

ZHAO Xiao-ying， LIU Xuan-ming

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(College of Biological Sciences， Hunan Univ， Changsha， Hunan 410082，China)

Abstract:Rad23 gene which participates in ubiquitin/26S proteasome pathway in Arabidopsis， is known to play important roles in plant development and responses to hormone. In order to study its function and molecular mechanism， an expression vector pCold-Rad23 was constructed and transformed into E. coli BL21. Then the recombinant fusion protein was induced by IPTG.The results of SDS-PAGE have shown that Rad23 fusion protein existed in a soluble form with a relative molecular mass 94 ku， which is fit for the molecular mass supposed from gene coding frame. Finally， the Rad23 recombinant fusion protein was used as an antigen to prepare polyclonal antiserum in mice. The western blot results have shown that the polyclonal antiserum has high specificity and can react to the native protein expressed in different tissues of Arabidopsis. 

Key words:protein; ubiquitin (Ub)/26S proteasome; prokaryotic expression; antibodies

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蛋白泛素化是真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一種蛋白翻譯后修飾方式，其在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡等多種生物途徑中發(fā)揮重要作用 ［1-2］.研究表明，作為一種復(fù)雜且高度調(diào)控的過程，蛋白質(zhì)泛素化需要3類酶參與催化，這3類酶分別稱為E1—泛素激活酶，E2—泛素耦聯(lián)酶，E3—泛素連接酶.泛素化的整個(gè)過程大致如下：在ATP的參與下，E1的半胱氨酸活性位點(diǎn)與泛素C末端的甘氨酸首先形成硫酯鍵；接著，連接在E1上的泛素被轉(zhuǎn)移到E2的活化半胱氨酸位點(diǎn)；最后在E3的催化下，泛素C末端與底物某個(gè)位點(diǎn)的賴氨酸氨基結(jié)合并被蛋白酶體識別和降解［3-6］.

目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有上千種基因表達(dá)產(chǎn)物具有泛素連接酶E3的功能［7-9］，它們主要通過介導(dǎo)泛素/26S蛋白酶體途徑，參與26S蛋白酶體調(diào)控細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解［10-11］.如Rad23(radiation sensitivity protein-23)就是其中的一種，該蛋白N端具有一個(gè)能夠和蛋白酶體結(jié)合的UBL(ubiquitin-like)區(qū)域，C端含有二個(gè)可和ubiquitin結(jié)合的UBA(ubiquitin-associated) 區(qū)域，其中起主要調(diào)控作用的是位于C端中心區(qū)域UBA1，去掉靠近C端末尾的UBA2區(qū)域并不影響ubiquitin結(jié)合功能［12-13］.這些特定結(jié)構(gòu)域的存在，使得Rad23蛋白能通過選擇性的與其他蛋白特定位點(diǎn)的結(jié)合，精確地調(diào)控蛋白泛素化，為泛素蛋白酶體精確調(diào)控相關(guān)蛋白降解奠定了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材 料

主要試劑：限制性核酸內(nèi)切酶Xho I，EcoR I，Taq DNA 聚合酶和T4 DNA 連接酶為MBI公司產(chǎn)品.ELISA試劑盒、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購自杰輝生物技術(shù)有限公司.RPMI1640和胎牛血清購于Invitrogen公司，弗氏佐劑購于Sigma公司.載體與菌株：菌株E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3) 和Sp2/0細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pCold-TF購買于TaKaRa公司.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小白鼠購自中南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心.

1.2 方 法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

公司pCold-Rad23重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定，以AT5G38470基因?yàn)槟０澹嫌我?′-CCGCTCGAGATGAAGATTTTCGTGAAGACT CTCA-3′(引入Xho I酶切位點(diǎn)) ，下游引物為5′-CCGGAATTCTTATTGATCTTCAAACTCATGC-3′(引入EcoR I酶切位點(diǎn)) .PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min.用Xho I和EcoR I分別雙酶切PCR 產(chǎn)物和pCold 原核表達(dá)載體，回收的酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行酶切及測序鑒定.

1.2.2 重組蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCold-Rad23 轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，取1 mL經(jīng)不同摩爾濃度IPTG誘導(dǎo)處理的細(xì)菌離心，去上清后加入SDS凝膠上樣緩沖液100 ℃煮沸5 min，12 000 r/min室溫離心5 min，取20 μL 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測蛋白表達(dá). 

1.2.3 鎳柱親和層析分離純化重組表達(dá)蛋白

將1 L經(jīng)0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)處理的pCold-Rad23陽性菌(BL21)收集離心，去上清后將沉淀重懸于Lysis buffer中4 ℃超聲波粉碎，12 000 r/min 離心，取上清和Ni2NTA agarose 混合，4 ℃條件下攪拌1 h，經(jīng)咪唑濃度梯度法分離純化蛋白(咪唑摩爾濃度分別為10，50，100，150，250 mmol/L )，純化蛋白用透析法去除咪唑，透析后的蛋白分裝凍存于-80 ℃.

1.2.4 擬南芥核蛋白提取

分別取野生型擬南芥的根、莖、葉、花組織2 g，加入4 mL提取緩沖液，勻漿破碎細(xì)胞，經(jīng)三層濾膜過濾后棄去沉渣，將上清液350 g，4 ℃，8 min離心，棄去上清，沉淀用含l%TritonX-100的提取緩沖液重懸；350 g，4 ℃離心8 min，棄去上清，沉淀再用提取緩沖液重懸；350 g，4 ℃離心8 min，收集沉淀并加入100 μL上樣緩沖液(2×)，混勻，金屬浴加熱10 min， -20 ℃保存.

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡檢測

以純化前后的pCold-Rad23蛋白樣品和擬南芥不同組織提取的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，然后將PVDF膜放甲醇溶液中浸泡5 min后，將膜和6張濾紙均用DTB緩沖液浸泡5 min，然后放置在半干轉(zhuǎn)移儀上進(jìn)行轉(zhuǎn)移.轉(zhuǎn)移1 h后，將膜用5%牛奶液封閉1 h.用PBST洗膜3次后，以鼠血清(將鼠血清按1∶3 000稀釋)為一抗溫育1 h；洗膜后以HRP標(biāo)記的羊抗鼠多抗(1∶3 000稀釋)為二抗溫育1 h；PBST液洗膜3次后，加入顯色液A和B顯色1 min，然后顯影.

2 結(jié) 果

2.1 pCold-Rad23重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

瓊脂糖凝膠電泳檢測以Rad23(AT5G38470)基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，可見大小為1 100 bp左右的特異性片段(圖1（a）).將雙酶切的PCR產(chǎn)物和pCold-TF大片段連接過夜后轉(zhuǎn)化E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提取經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒DNA，XhoⅠ和EcorⅠ雙酶切結(jié)果表明：陽性質(zhì)粒可切出約1 137 bp的目的片段(圖1（b）)，將該片段進(jìn)行測序后與NCBI提供的序列相比對，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與檢索序列完全一致.

2.2 pCold-Rad23蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將鑒定正確菌株，接種到LB培養(yǎng)基中，搖菌2 h后，加入不同濃度的IPTG，比較IPTG誘導(dǎo)濃度對融合蛋白表達(dá)影響的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)24 h后，即在約94 ku處有目的蛋白條帶的出現(xiàn)，重組蛋白對IPTG濃度變化(從0.2 mmol/L到1.0 mmol/L)不敏感(圖2)，但未加入IPTG條件下，重組目的蛋白

基本沒有誘導(dǎo)表達(dá).隨后，通過對構(gòu)建的重組蛋白分別在不同溫度、不同時(shí)間和不同OD值條件下誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在不同誘導(dǎo)溫度下，低溫(0~13 ℃)和較高溫度(18~30 ℃)下蛋白表達(dá)較少，蛋白表達(dá)最適合溫度為15 ℃.重組蛋白表達(dá)量受誘導(dǎo)時(shí)間(從2 h到30 h)和誘導(dǎo)菌液OD值(從OD0.2到OD1.4)影響較大(數(shù)據(jù)另文發(fā)表).

2.3 pCold-Rad23蛋白純化

誘導(dǎo)24 h的菌體蛋白經(jīng)6×His標(biāo)簽親和層析吸附后，利用不同濃度咪唑(從10 mmol/L到100 mmol/L)梯度洗脫，將收集液體經(jīng)12％SDS-PAGE分離，結(jié)果顯示：在10 mmol/L咪唑下目的蛋白和雜蛋白都被洗脫下來，而在50 mmol/L咪唑濃度條件下，很少有目的蛋白被洗脫下來，說明在10 mmol/L咪唑濃度下蛋白還有未完全結(jié)合的目的蛋白，而在100 mmol/L咪唑濃度梯度下的目的蛋白被大量洗脫下來(圖3)，而且雜蛋白很少，利用咪唑濃度梯度法，得到了較純的94 ku目的條帶 (圖3)，所制得的重組抗原可以用于免疫動(dòng)物制備抗血清.

2.4 Western-blotting 鑒定

為了檢測制備血清的特異性，我們利用Western-blotting考察了該血清對純化前后重組蛋白的識別效果.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)可以看出：多克隆血清與重組蛋白雜交后可在膠片上產(chǎn)生特異性條帶，分子質(zhì)量為94 ku左右，條帶大小與預(yù)期重組蛋白太小完全相符.此外，我們進(jìn)一步考察了多克隆血清識別擬南芥細(xì)胞Rad23蛋白的可能性，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)：擬南芥的不同組織樣品蛋白均能與制備的抗體特異性作用，在分子質(zhì)量為40 ku的位置均能產(chǎn)生特異性條帶，與推測擬南芥Rad23蛋白的分子質(zhì)量一致，在檢測的樣品中，該基因在花中表達(dá)最多，莖中較少，這些結(jié)果證明制備的抗體具有高特異性.

3 討 論

本研究利用分子克隆了Rad23基因，并采用原核高效表達(dá)載體表達(dá)了pCold-Rad23蛋白.該載體系TaKaRa公司最近推出的一種新的高效表達(dá)載體，它含有一個(gè)cspA(cold shock pretein A)啟動(dòng)子能夠促進(jìn)重組蛋白在低溫下大量表達(dá)，同時(shí)在低溫條件下亦可抑制其他雜蛋白表達(dá)，有趣的是該載體還含有一個(gè)TF結(jié)構(gòu)的伴侶蛋白，該結(jié)構(gòu)能促進(jìn)融合目的蛋白的正確折疊，有利于重組蛋白在上清中表達(dá).與現(xiàn)階段一些原核表達(dá)載體相比，該載體特有的結(jié)構(gòu)不僅能促進(jìn)目的蛋白在上清高效表達(dá)，還可降低其他雜蛋白的產(chǎn)生，為下一步純化提供了便捷.

在酵母中已開展了許多關(guān)于Rad23蛋白家族功能研究工作，但在植物體內(nèi)其具體作用機(jī)制還不是很清楚，為進(jìn)一步研究植物體內(nèi)Rad23蛋白的具體功能和相關(guān)作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了pCold-Rad23基因重組蛋白，并制備了具有高效特異的抗體，該抗體不但能識別重組蛋白，還特異性識別植物體內(nèi)的天然蛋白，WB鑒定發(fā)現(xiàn)該天然蛋白主要在擬南芥花和葉中表達(dá)較多，而在植物的莖中表達(dá)較少，這可能與該基因家族具有抗紫外修復(fù)功能有關(guān).最近研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)Rad23基因家族參與了泛素/26S蛋白酶體途徑［11］，參與相關(guān)蛋白的調(diào)控，但其具體作用機(jī)制還不是研究得很清楚，還需進(jìn)一步對Rad23蛋白在植物體內(nèi)作用機(jī)制開展研究.

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