固相微萃取法測定卷煙主流煙氣中的游離煙堿

摘 要：通過頂空固相微萃取進樣器（HS-SPME）對卷煙主流煙氣劍橋濾片中的游離煙堿進行萃取，并用氣相色譜/質譜（GC/MS）進行外標法定量分析，對溶劑、萃取纖維、預平衡時間、萃取時間、萃取溫度、脫附時間等分析條件進行了優化.同時建立了濾片不同含水量對游離煙堿測定影響的校正曲線，根據實際樣品主流煙氣粒相物水分的含量對游離煙堿的測定值進行校正，實現了對游離煙堿存在環境無干擾的條件下簡便、快速、準確測定卷煙主流煙氣粒相物中的游離煙堿.以參比卷煙3R4F為實際樣品進行測定時，本方法的RSD為8.3%，檢測限和定量限分別為0.2 μg/支和0.5 μg/支.

關鍵詞：游離煙堿；卷煙主流煙氣；卷煙工業；頂空固相微萃??；色譜分析；氣相色譜/質譜法

中圖分類號：O656.31 文獻標識碼：A

Determination of Free-base Nicotine

in Main-stream Cigarette Smoke by HS-SPME GC/MS

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WANG Qiu-an1，WANG Ming-feng2，ZHE Wei2， HE Liang2， ZHU Biao-kun2， LIAO Tou-gen2

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(1．College of Chemistry and Chemical Engineering， Hunan Univ，Changsha，Hunan 410082， China;

2．RD Center of Hongyunhonghe Tobacco Group Co， Ltd， Kunming，Yunan 650202， China)

Abstract:

An improved， rapid method to measure free-base nicotine in mainstream cigarette smoke accurately by commercial headspace solid phase microextraction (HS-SPME) combined with GC/MS was established. The factors which play important roles in the determination of free-base nicotine， such as the solvent used for preparation of standards， SPME fiber， pre-equilibrium time before HS-SPME， extraction temperature and time， desorption time， were optimized carefully. Furthermore， an experimental water correction factor based on the water content of particulate phase was established to correct free-base nicotine in actual samples. The precision of the method was evaluated with smoke samples of reference cigarettes (Kentucky reference 3R4F) and the RSD obtained was 8.3%. The calculated limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were 0.2 and 0.5 μg/cig， respectively.

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Key words: free-base nicotine；mainstream cigarette smoke；cigarette manufacture；headspace solid-phase microextraction (HS-SPME)；chromatographic analysis;GC/MS

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卷煙主流煙氣中迄今為止鑒定了5 000余種化合物，但煙堿在這些化合物中起到了重要的作用并因此激發了科學家們更多的研究興趣［1-3］.1970年，Armitage等［1］發現游離煙堿比質子態煙堿具有更強的親脂性，更易于穿透口腔黏膜從而更快速地被人體吸收.人們針對游離煙堿在人體中的吸收代謝［2-3］、游離煙堿的成癮性以及游離煙堿與卷煙抽吸品質［4-5］等方面開展了大量的工作.研究結果表明：游離煙堿的含量與卷煙抽吸品質存在明顯的線性相關，同時也具有較強的成癮性.圍繞卷煙開發及危害性評估，人們開展了大量游離煙堿檢測方法的研究工作，主要有：1）煙氣及pH測定法［4，6-9］；2）溶劑萃取法［4，7-9］；3）1H NMR測定法［10］；4）氣袋捕集法［11］；5）固相微萃?。⊿PME）法［12-13］.然而，在卷煙主流煙氣中，游離煙堿的比例隨著溫度、水分、煙氣及pH等環境因素的變化而變化［12］.溶劑萃取和核磁共振測定法會引起游離煙堿存在環境的改變，破壞游離煙堿和質子態煙堿之間的平衡；pH測定法也由于測定精度和測定對象的置信度問題而存在一定的缺陷；氣袋捕集主流煙氣測定方法存在操作復雜、重現性差等問題；相對而言，SPME方法具有對煙氣干擾少、測定快速等的優點.Bao等［12］采用SPME-GC/MS法對主流煙氣中游離煙堿進行測定時，引入了氘代甲苯作為方法的內標物質，但在實驗中不同卷煙煙氣的濾片會影響氘代甲苯的釋放量，從而影響了游離煙堿的準確測定.本文采用改進的SPME法直接測定卷煙主流煙氣中的游離煙堿，樣品測定過程無外加試劑，在不改變游離煙堿存在環境的條件下簡便、快速、準確地測定卷煙主流煙氣粒相物中的游離煙堿，具有對煙氣干擾少、測定準確度高、前處理簡單、無外加溶劑以及方便快捷等優點.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑和材料

煙堿，純度≥99%；正己烷，色譜純（Fisher公司，美國）；超純水，18 MΩ（Millipore純水儀自制）；3R4F參比卷煙（Kentucky大學，美國）；配備頂空固相微萃取自動進樣器的GC/MS氣相色譜/質譜聯用儀（Agilent公司，美國）；ZB-624彈性毛細管14%氰丙基苯和86%二甲基聚硅氧烷柱，30 m（長度）×0.32 mm（內徑）×1.8 μm（膜厚）（Phenomenex公司，美國）；65 μm聚二甲基硅氧烷/苯乙烯（PDMS/DVB）固相微萃取頭，部分交聯（Supelco公司，美國）；RM-20H圓盤式吸煙機（Borgwaldt公司，德國）；玻璃纖維濾片，直徑44 mm；分析天平，感量0.1 mg；手動微量進樣針；各種規格棕色容量瓶.

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作樣品的準備

空白玻璃纖維濾片及20 mL帶蓋頂空瓶在100 ℃烘箱中干燥5 h，待水分去除后放置于干燥皿中保存待用.將空白玻璃纖維濾片均勻分割為兩半，分別放置于5個20 mL頂空瓶中(每瓶放置半個濾片).配制體積濃度分別為5，10，25，50，100 g/L的煙堿標準工作溶液，以正己烷定容.在5個頂空瓶中的濾片上分別準確加入1 μL上述不同體積濃度的煙堿標準工作溶液，在30 ℃平衡5 h后進行分析測試.

1.2.2 樣品準備

卷煙樣品放置于恒溫恒濕箱（20 ℃，RH60%）平衡48 h，按照《常規分析卷煙吸煙機定義和標準條件》(ISO 3308∶2000)抽吸條件抽吸5支卷煙，抽吸前檢查抽吸容量，并作相應修正.玻璃纖維濾片捕集煙氣粒相物部分后，均勻分割為兩半，一半濾片樣品放置于20 mL頂空瓶中并密封，在30 ℃平衡5 h后進行分析測試；另一半濾片樣品按照《卷煙總粒相物中水分的測定氣相色譜法》(YC/T 157-2001)測定其水分含量.每批樣品測試時均使用空白樣品以避免外源污染.

1.2.3 水分校正樣品的準備

空白玻璃纖維濾片及20 mL帶蓋頂空瓶在100 ℃烘箱中干燥5 h，待水分去除后放置于干燥皿中保存待用.將濾片均勻分割為兩半，放置于頂空瓶中（每瓶放置半個濾片），分別加入水分校正工作溶液（見表1），樣品中游離煙堿的總量為25 μg，在30 ℃平衡48 h后上機測試.

1.2.4 固相微萃取條件

預平衡溫度設定30 ℃，預平衡時間設定600 s，萃取時間設定600 s，脫附時間設定180 s，進樣后固相微萃取針洗脫溫度設定為250 ℃，洗脫時間為900 s，采用高純氮氣為洗脫氣（純度≥99.999%），氣體壓力設定為0.2 MPa. 

1.2.5 色譜分析條件

以氦氣（純度≥99.999%）為載氣，恒流模式，流量為1.5 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；采用分流進樣方式，分流比20∶1；升溫程序為初始溫度50 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升溫速率升至210 ℃，保持2 min，以30 ℃/min的升溫速率升至240 ℃，保持3 min；電離方式采用電子轟擊源（EI），電離能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；傳輸線溫度為250 ℃.

采用選擇性離子掃描模式分段掃描，以特征離子84進行定量分析，分子離子峰163和碎片離子峰133為輔助定量離子.

2 結果與討論

2.1 分析條件的優化

2.1.1 溶劑對游離煙堿測定的影響

為避免加入的溶劑與游離煙堿產生競爭性吸附以及防止SPME萃取頭的溶脹效應，實驗考察了非極性的正己烷對游離煙堿測定的影響.以3R4F參比卷煙主流煙氣的濾片為實驗對象，分別加入0~5 μL正己烷.結果表明（見圖1）：正己烷的加入量對游離煙堿的響應峰面積沒有顯著影響，因此實驗選擇正己烷作為標準曲線配制的溶劑，并選擇1 μL作為加入量.

正已烷的體積/μL

2.1.2 萃取纖維對游離煙堿測定的影響

為了使煙氣中的游離煙堿能夠被快速、有效地萃取，實驗考察了7種常用于測定揮發性、半揮發性化合物的商品化萃取纖維對氣態游離煙堿的萃取效果（萃取纖維信息詳見表2）.實驗結果表明，PDMS/DVB的萃取纖維對半揮發性游離煙堿的選擇性較好，雜質影響小，且萃取效率較高.綜合考慮萃取纖維的選擇性及萃取效率，最終選擇PDMS/DVB萃取纖維(65 μm，部分交聯)作為實驗的萃取纖維.

2.1.3 預平衡時間對游離煙堿測定的影響

為保證數據的準確及穩定，實驗考察了卷煙煙氣粒相物中的游離煙堿在濾片及氣相之間達到平衡的時間.通過捕集3R4F參比卷煙的煙氣粒相物，將其置于30 ℃進行平衡，并根據平衡時間及游離煙堿的響應峰面積進行作圖，實驗結果如圖2所示.在30 ℃平衡5 h之后，游離煙堿的響應峰面積達到平臺，表明游離煙堿在濾片和氣相中已達到平衡，并且在48 h內保持穩定.因此，在進行游離煙堿測定時，樣品應在30 ℃平衡5 h后再進行測定，并且處理好的樣品應在48 h內分析完畢.

預平衡時間/h

2.1.4 萃取溫度及時間對游離煙堿測定的影響

游離煙堿為半揮發性化合物，升高溫度有利于游離煙堿在濾片和氣相中達到平衡，但是在測定游離煙堿時，通?？疾斓氖浅叵碌挠坞x煙堿的含量，因此實驗采用自動進樣器的最低設定溫度30 ℃作為方法的萃取溫度.同時，考慮到煙氣粒相中的游離煙堿在濾片、氣相及固相微萃取纖維之間的平衡時間將影響方法的穩定性及重現性，實驗考察了固相萃取纖維在頂空瓶氣相部分進行萃取的時間.通過濾片捕集3R4F參比卷煙主流煙氣粒相物，30 ℃平衡5 h后進樣，根據萃取時間及游離煙堿響應峰面積進行作圖，實驗結果如圖3所示.結果表明，在10 min萃取時間內，萃取量基本達到最大萃取時間（100 min）同一數量級范圍，其靈敏度也滿足分析要求，考慮到樣品游離煙堿含量的差異，SPME萃取頭必須有足夠的冗余以分析含量高的樣品，因此，選擇10 min為最佳萃取時間.

萃取時間/min

2.1.5 脫附溫度及時間對游離煙堿測定的影響

脫附即是通過高溫將吸附于固相微萃取纖維上的分析物瞬間釋放出來，溫度越高，釋放速率越快，峰形也更好，但是過高的溫度會損壞萃取纖維，所以脫附溫度采用的固相微萃取纖維的推薦溫度為250 ℃.脫附時間對3R4F參比卷煙煙氣中游離煙堿響應峰面積的影響如圖4所示.當脫附時間到180 s后游離煙堿響應峰面積達到平臺，表明煙堿已脫附完全，選擇180 s作為最優脫附時間.同時，為避免樣品之間的交叉污染，保證固相微萃取纖維的萃取吸附效率，每次進樣后均采用高純氮氣對固相微萃取纖維進行洗脫除雜，洗脫溫度為250 ℃，洗脫時間為900 s.

2.2 樣品水分對游離煙堿測定的影響

在3R4F參比卷煙的煙氣樣品中分別加入0，1，5，10 μL的超純水，在30 ℃平衡5 h后進樣，根據萃取時間及游離煙堿響應峰面積進行作圖，實驗結果如圖5所示.當樣品水分含量增大時，游離態的煙堿量急劇減少，表明水分含量的高低對游離煙堿在濾片和氣相中的分配具有較大的影響.然而，不同品牌、不同規格卷煙煙氣的水分含量變化范圍很大，要準確測定煙氣中游離煙堿的含量，就需要在游離煙堿及煙氣水分含量之間建立相關關系.將干燥的空白濾片均勻分割為兩半，放置入7個20 mL頂空瓶中（每只瓶中放入半個濾片），分別向其中6個頂空瓶內加入25.0，20.0，10.0，8.0，5.0，2.0 μL體積濃度為1.0，1.3，2.5，3.1，5.0，12.5 g/L的煙堿水溶液（以超純水為溶劑），向第7個頂空瓶內加入1 μL體積濃度為25 g/L的煙堿標準溶液（以正己烷為溶劑），在30 ℃下放置48 h后進行測定.將實驗數據進行回歸分析表明，游離煙堿響應峰面積的倒數與濾片水分含量具有顯著的線性相關，線性相關系數R2大于0.99（如圖6 (b)所示）.因此，要準確測定不同含水量的卷煙煙氣樣品中的游離煙堿，可以通過建立水分校正標準曲線來對游離煙堿的實際值進行校正.

為驗證水分校正曲線在測定游離煙堿時的準確性，實驗捕集了3R4F參比卷煙的煙氣粒相物，將捕集到的濾片均勻分割為兩半，一半濾片樣品平衡后用固相微萃取法直接進行分析；另一半濾片樣品則分別加入5，10，15，20，25 mg的超純水，30 ℃平衡48 h后進行分析，并用水分校正曲線（如圖6）對測定結果進行校正，實驗結果如圖7所示.進行水分校正后，游離煙堿的測定值能與實際值較好地吻合.

2.3 方法評價

2.3.1 方法的標準曲線、檢出限和定量限

根據優化的分析方法，建立了分析方法的標準曲線，將干燥后的空白玻璃纖維濾片均勻分割為兩半，分別放置于5個20 mL頂空瓶中(每瓶放置半個濾片)，分別準確加入1 μL體積濃度分別為5，10，25，50，100 g/L的煙堿標準工作溶液，在30 ℃平衡5 h后進行分析測試，得到方法典型的標準曲線如圖8所示.采用標準曲線最低濃度的標準溶液平行測定10次，并計算其標準偏差，得到方法的檢測限（LOD）為0.2 μg/支，定量限（LOQ）為0.5 μg/支.

2.3.2 方法的精密度

以3R4F參比卷煙為實驗對象，平行測定10份樣品中的游離煙堿，樣品平均值為15.02 μg/支，測定相對標準偏差為8.3%，方法精密度達到檢測要求.

3 結 論

利用頂空固相微萃?。℉S-SPME）與氣相色譜/質譜（GC/MS）聯用，采用外標法定量直接測定卷煙主流煙氣中的游離煙堿，整個測定過程無外加試劑，對游離煙堿和質子態煙堿之間所存在的平衡干擾少，不改變游離煙堿存在的環境，簡便、快速、準確地測定卷煙主流煙氣粒相物中的游離煙堿.方法的檢測限和定量限分別達到0.2和0.5 μg/支，數據穩定可靠，可滿足卷煙主流煙氣中游離煙堿的測定要求.

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