不同換液體積和血清對黃牛孤雌胚體外發育的影響

摘要：試驗研究了牛胚胎體外培養過程中不同換液體積及血清滅活與否對黃牛孤雌胚胎體外發育潛力的影響，結果表明，以ＳＯＦａａ為基礎培養液，在更換培養液體積１／２組與１／４組和３／４組之間的黃牛孤雌胚胎囊胚率有顯著差異（Ｐ＜０．０５），分別為３８．８４％、２３．３９％和２１．７１％；不同處理的血清添加組的卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率均無顯著差異（Ｐ＞０．０５）。

關鍵詞：牛；孤雌胚胎；體外培養

中圖分類號：Ｓ８２８．３＋６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1413-03

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃｈａｎｇｉｎｇ Ｍｅｄｉａ Ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ＦＢＳ ｏｎ Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｓ iｎ Ｖｉｔｒｏ

ＷＵ Ｓｈｕ－ｘｉａｎ１，ＬＩ Ｌｉ２，ＳＵＮ Ｓｈｉ－ｄｕｏ１，ＱＩＡＯ Ｘｉａｎ－ｆｅｎｇ２，ＺＨＥＮＧ Ｘｉｎ－ｍｉｎ２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００，Shaanxi，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅs／Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｍｅｄｉａ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｕｎ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｔｙ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｒａｔｅｓ ｏｆ １／２ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｏｆ １／４ ａｎｄ ３／４ ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５） when SOFaa was used as the basic medium， they were 38.84%， 23.39%， 21.71% respectivily． Ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｓ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ ｕｎ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｅｒｕｍ ｇｒｏｕｐｓ （Ｐ﹥０．０５）．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂｏｖｉｎｅ； ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ； ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ

胚胎體外培養是一項相當復雜的工作，因為胚胎發育要經過早期卵裂、突破發育阻滯、桑椹胚、囊胚及孵化囊胚等階段，影響因素較多［１］。利用孤雌激活技術篩選出最佳的卵母細胞成熟培養條件和胚胎培養條件，然后再應用于體外受精體系，就可以篩選出最佳的精子用于體外受精［２］，如此一來，將孤雌激活技術與體外受精技術相結合，使卵母細胞體外成熟、體外受精和胚胎培養３個主要環節可以獨立進行研究，更容易對影響體外受精效率的諸多因素進行分析，發現其中的問題所在，直至篩選或摸索出最佳培養條件，從而提高體外受精效率。通過類似途徑，也可以選擇更合適的激活條件（包括電激活、化學激活和生物激活等）應用于孤雌生殖或核移植技術的研究。本試驗主要研究了牛孤雌胚胎體外培養過程中不同換液體積和血清滅活與否對其發育潛力的影響，以期找到一種適合實驗室條件穩定的牛孤雌胚胎體外培養系統，并且為牛體外受精胚的制備以及核移植試驗提供參考。

１材料與方法

１．１卵丘卵母細胞復合體的收集與體外成熟培養

黃牛卵巢從當地屠宰場回收，牛宰殺后３０ ｍｉｎ內取出卵巢，置于含有青霉素、鏈霉素的３５℃左右的ＰＢＳ液保溫瓶內，在４ ｈ內帶回實驗室，用３５～３７℃的ＰＢＳ液（不含雙抗）沖洗３～４遍。用５ ｍＬ的注射器和１６號針頭從卵巢的小卵泡（２～８ ｍｍ）中吸出未成熟的卵母細胞，在體視顯微鏡下挑選出具有完整卵丘細胞層或部分致密卵丘細胞的卵子，用洗卵液清洗３次，然后用培養液洗３次，移到事先準備好的成熟培養液小滴中進行成熟培養。每個培養小滴中放入１０～１５個卵母細胞，在５％ＣＯ２、３９℃、１００％濕度條件下培養２２～２４ ｈ。洗卵液為ＴＣＭ－１９９＋５％ＦＢＳ。ＩＶＭ液為ＴＣＭ－１９９（Ｇｉｂｃｏ）＋２５ ｍｍｏl/L谷氨酰胺（Ｇｉｂｃｏ）＋０．１ＩＵ／ｍＬ ＨＭＧ（Ｓｉｇｍａ）＋１ μＬ／ｍＬ Ｅ２＋１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）。

１．２孤雌激活

卵母細胞成熟２４ ｈ后，除去顆粒細胞，選取有第一極體排出且胞質均勻的成熟卵母細胞，在含

５ μｍｏｌ／Ｌ Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（離子霉素）的ＳＯＦａａ（輸卵管培養液）中激活５ ｍｉｎ， 用培養液清洗３次，然后再用含２ ｍｍｏｌ／Ｌ ６－ＤＭＡＰ的ＳＯＦａａ激活４ ｈ，用培養液清洗３次，放入預先制備的顆粒細胞單層共培養體系中進行培養。

１．３孤雌胚的體外培養

胚胎培養液ＳＯＦａａ：ＳＯＦ［３］ ＋1．０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－谷氨酰胺＋８ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ＋２％（Ｖ／Ｖ）Ｅａａ＋１％（Ｖ／Ｖ） ＮＥａａ＋１００ ＩＵ／ｍＬ 青霉素＋１００ μｇ／ｍＬ 鏈霉素。

１．４單層顆粒細胞（ＧＣ）的制備

吸取成熟培養后離散的顆粒細胞液５ ｍＬ加至１０ ｍＬ滅菌的離心管中，加入２ ｍＬ用ＴＣＭ－１９９配制的０．２％透明質酸酶溶液，１ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ后，棄去上清，加入適量成熟液洗滌３次，使其最終濃度為１×１０７個／ｍＬ。吸?。保?μＬ該液，加入已在ＣＯ２培養箱中平衡好的培養微滴（１００ μＬ）中，使其最終濃度為１×１０６～２×１０６個／ｍＬ，置ＣＯ２培養箱中培養３２～４８ ｈ備用。

１．５轉綠色熒光蛋白基因小鼠胚胎成纖維細胞（ＧＦＰ-ＭＥＦ）的制備

來自１２～１５ ｄ轉綠色熒光蛋白基因胎鼠，去頭、尾、內臟和四肢后，用０．２５％的胰酶，３７℃消化３０ ｍｉｎ后過雙重２００目濾網，離心收集細胞沉淀，用含１０％ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ高糖培養液重懸，置于ＣＯ２培養箱，５％ＣＯ２、３７℃和１００％濕度條件下培養８ ｈ，待細胞７０％～８０％匯合后，按１∶３比例常規傳代，３～４代后便可得到純化的ＧＦＰ－ＭＥＦ。用含１０％ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ細胞培養液做成細胞密度為１×１０６～２×１０６個／ｍＬ的細胞懸液，在直徑為３５ ｍｍ平皿中制成１００ μＬ懸浮液小滴，覆蓋礦物油后，置ＣＯ２培養箱，５％ＣＯ２、３７℃和１００％濕度條件下培養，細胞單層形成后，用作胚胎培養。

１．６試驗設計

１）以ＳＯＦａａ為基礎培養液，分別將孤雌激活的胚胎培養在ＧＣＭ單層和ＧＦＰ-ＭＥＦ單層的共培養體系中，探討不同細胞單層對黃牛孤雌胚胎體外發育的影響，尋找最合適的共培養體系。

２）以ＳＯＦａａ為基礎培養液，將牛孤雌胚胎培養在１００ μＬ微滴中，每４８ ｈ分別更換培養微滴體積的１／４、１／２和３／４，探討不同換液體積對牛孤雌胚胎體外發育的影響，得出最佳換液體積。

３）以ＳＯＦａａ為基礎培養液，將牛孤雌胚胎培養在１００ μＬ微滴中，每４８ ｈ半量換液，在孤雌激活的第３天分別添加１０％的滅活和未滅活ＦＢＳ，探討血清的滅活情況對孤雌胚體外發育的影響。

１．７統計分析

數據以平均數和標準差表示，用ＳＰＳＳ １６．０統計軟件進行方差分析。

２結果

２．１不同的共培養體細胞對黃牛孤雌胚體外發育的影響

由表１可見，采用單層顆粒細胞（ＧＣ）和轉綠色熒光蛋白基因小鼠胚胎成纖維細胞（ＧＦＰ-ＭＥＦ）共培養組的卵裂率與對照組相比均無顯著差異（Ｐ＞０．０５），而囊胚率均顯著高于對照組（Ｐ＜０．０５）；對照組未出現孵化囊胚，ＧＣ共培養組和ＧＦＰ-ＭＥＦ共培養組的孵化囊胚率分別為４３．８４％和４５．７１％，極顯著高于對照組（Ｐ＜０．０１）；采用ＧＣ共培養和采用ＧＦＰ-ＭＥＦ共培養組的卵裂率、桑椹胚率、囊胚率均無顯著差異（Ｐ＞０．０５）。

２．２不同換液體積對黃牛孤雌胚體外發育的影響

由表２可見，就囊胚率而言，每次更換培養液體積１／２組與１／４組和３／４組之間有顯著差異（Ｐ＜０．０５），其囊胚率分別為３８．８４％、２３．３９％和２１．７１％，但１／４組與３／４組之間無顯著差異（Ｐ＞０．０５）。３組之間在卵裂率和孵化囊胚率方面差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。由此可以看出，牛孤雌胚胎體外培養過程中，每次更換培養液體積的１／２可以取得較好的培養效果。

２．３血清滅活對黃牛孤雌胚體外發育的影響

由表３可見，不同處理的血清添加組的卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率均無顯著差異（Ｐ＞０．０５），但未滅活組略優于滅活組。因此，添加的血清是否滅活對牛孤雌胚胎體外發育的影響不大。

３討論

３．１不同的共培養體細胞對黃牛孤雌胚體外發育的影響

胚胎與體細胞共同培養的方法可以有效地克服發育阻滯的發生，從而促進胚胎體外的早期發育。以往的研究中，胎鼠成纖維細胞主要是用于胚胎干細胞的共培養［４，５］，來自胚胎早期的成纖維細胞可分泌多種細胞因子，其中白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ，ＬＩＦ）對維持ＥＳ細胞的未分化狀態有重要作用［６，７］。同樣，這些細胞生長因子對胚胎的體外發育也有很大的作用。本試驗中采用轉綠色熒光蛋白基因小鼠胚胎成纖維細胞（ＧＦＰ-ＭＥＦ）作為滋養層細胞，并與顆粒細胞（ＧＣ）進行比較，為黃牛孤雌胚的體外共培養提供了一條新途徑，結果顯示ＧＦＰ-ＭＥＦ共培養組與牛ＧＣ組的卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率差異均不顯著?？梢?，滋養層細胞與胚胎是否來源于同一物種并不重要。這與Ｇｏｔｏ等［８］的試驗結果相符，他們將牛ＩＶＦ胚胎分別與牛顆粒細胞、１０日齡雞胚皮膚細胞、１０日齡小鼠胚胎的睪丸細胞和１０日齡雞胚胎的肝細胞在Ｍ１９９液中共培養，發育到囊胚的比率分別為５３．３％、４２．９％、４９．３％和４４．３％，差異不顯著。

３．２不同換液體積對黃牛孤雌胚體外發育的影響

在胚胎的體外培養中，胚胎多置于一種培養基中，換液的一個重要作用就是補充胚胎生長發育所需要的營養物質，哺乳動物早期胚胎在體內發育時，其代謝廢物由生殖道微環境清除，而胚胎在體外培養過程中其代謝廢物就只有通過換液來清除或稀釋，因此換液量的多少對胚胎的體外發育至關重要。本試驗在胚胎的體外培養過程中每次分別更換培養微滴體積的１／４、１／２和３／４，結果表明，就囊胚率而言，每次更換培養液體積１／２組（３８．８４％）與１／４組（２３．３９％）和３／４組（２１．７１％）之間有顯著差異（Ｐ＜０．０５）。由此可以看出每次換液量的多少都會對牛孤雌胚胎體外發育造成影響，其影響因素主要來自３個方面：其一是顆粒細胞和早期胚胎都有自分泌和旁分泌作用，其分泌的物質作用于其他胚胎并促進胚胎生長發育，換液時使顆粒細胞和胚胎所分泌的物質濃度降低；其二是由于胚胎發育過程中消耗了培養液中的部分營養物質，因而使某些營養物質低于正常培養液中的含量，換液時新加入的培養液與原來的培養液混合后不能使胚胎生長所需要的營養物質達到合適的濃度；其三是胚胎生長都有代謝廢物排出，代謝廢物達到一定濃度就會對胚胎發育不利。更換培養液體積的１／４和３／４時，可能使培養液中各組分濃度變化較大，超過胚胎所能承受的閾值，從而導致胚胎的囊胚率下降；更換培養液體積的１／２時效果最好，可能是使胚胎生長發育所需要的營養物質濃度、顆粒細胞和胚胎自分泌或旁分泌的物質濃度以及胚胎代謝廢物的濃度達到合適的配比，胚胎既有足夠的營養物質和有效濃度的自分泌或旁分泌物質，又不至于受到代謝廢物的影響。

３．３血清滅活對黃牛孤雌胚體外發育的影響

血清是目前牛ＩＶＦ胚胎體外培養系統中添加的重要成分。有研究結果表明，牛ＩＶＦ胚胎與體內受精胚胎相比在超微結構上存在顯著差距［９］，培養系統中血清的添加與否會顯著影響胚胎的超微結構，并進一步影響到胚胎的生理特性［１０，１１］。血清使用的通常做法是在添加之前對其進行滅活，以滅活血清中的補體成分。有研究認為組織培養過程中血清滅活是不必要的［１２］，而未滅活血清能夠抑制部分細菌的存活［１３］。還有研究表明ＦＣＳ滅活與否對牛ＩＶＦ胚胎的卵裂率、囊胚發育率以及囊胚細胞數均無顯著影響［１４］。本試驗分別在孤雌激活后的第3天添加１０％的滅活和未滅活ＦＢＳ，比較血清滅活與否對牛孤雌胚胎體外發育的影響，結果表明，就囊胚率和孵出囊胚率而言，滅活組與未滅活組之間均無顯著差異（Ｐ＞０．０５），但未滅活組略優于滅活組?？赡艿脑驗闇缁钸^程使血清中對胚胎體外發育有益的生長因子、激素和細胞因子等失活或滅活，進而不能有效的促進胚胎發育。但也有人認為血清在添加之前進行滅活處理對胚胎的發育有利，并與未滅活組有顯著差異，這可能是由于所使用的血清廠家不同、產地不同或生產批次不同所致。

因此，在牛孤雌胚胎體外培養過程中，每次更換培養液體積的１／２可以取得較好的培養效果，而添加的血清是否滅活對其體外發育的影響不大。

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