Fe²⁺對雄性泥鰍生殖毒性的研究

摘要：以泥鰍（Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ）精子為受試材料，應用計算機輔助精子分析（ＣＡＳＡ）系統，研究了亞鐵離子（Ｆｅ２＋）對雄性泥鰍的生殖毒性。在預實驗的基礎上，設置３０、６０和３００ μｍｏｌ／Ｌ ３個Ｆｅ２＋濃度梯度。泥鰍精子暴露０、０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，測定運動百分數、時間和速度等精子運動參數。結果表明，６０ ｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ２＋溶液明顯影響泥鰍的精子運動時間和相對速度（Ｐ＜０．０５）。高濃度的Ｆｅ２＋能夠抑制泥鰍精子運動，對泥鰍具有潛在生殖毒性作用。

關鍵詞：亞鐵離子（Ｆｅ２＋）；泥鰍；精子運動；生殖毒性

中圖分類號：Ｒ９９４．６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1444-03

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｂｏｕｔ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｆｅ２＋ ｔｏ ｔｈｅ Male Ｌｏａｃｈ，

Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ

ＣＨＥＮ Ｙｕ-ｍｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｊｉｅ，ＷＡＮＧ Ｙｕｅ-ｗｅｎ，ＨＵ Ｊｉａ-ｈｕｉ，ＣＨＥＮ Ｆｅｎｇ-ｍｅｉ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ ２５２０５９，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｆｅ２＋ ｏｎ ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｏｆ ｌｏａｃｈ（Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ） ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ Cｏｍｐｕｔｅｒ－Aｓｓｉｓｔｅｄ Sｅｍｅｎ Aｎａｌｙｚｅｒ （ＣＡＳＡ）． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｌｏａｃｈ ｓｐｅｒｍ ｗａｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｉｎ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｅ２＋ （３０， ６０， ａｎｄ ３００ μｍｏｌ／Ｌ） ｆｏｒ ０， ０．５， １.0， ２.0 ａｎｄ ４.0 ｈ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ， ｄｕｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｒｏｎ ｉｏｎ ｏｆｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｒｅｄｕｃｅｄ significantly ａｔ ６０ ｍｏｌ／Ｌ ｏｆ Ｆｅ２＋（Ｐ＜０．０５）． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｒｏｕｓ ｉｏｎｓ ｗｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄａｍａｇｅ ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏａｃｈ， ａｎｄ ｍｉｇｈｔ ｈａｖｅ ｈａｒｍｆｕｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｌｏａｃｈ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｅｒｒｏｕｓ ｉｏｎ； ｌｏａｃｈ； ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ； ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ

鐵是動物體內必需的微量元素，是血紅素、細胞色素的重要組成部分，可參與多種生命活動過程，機體內的鐵代謝平衡是保證生命活動正常進行的基礎［１］。隨著現代化進程的加快，鐵礦業的膨脹和工業廢水排放的增加，水環境中鐵離子濃度呈升高趨勢［２］。水環境中鐵濃度的升高已對生物的生存及生物多樣性產生了嚴重影響，對敏感物種的危害更大［３］。

對生活在污染水體中的淡水魚而言，成熟配子排入水中后，直接與水環境中的污染物接觸，首先使配子受到傷害，進而降低受精率和孵化率，還會對幼體發育產生重大影響。近年來，以動物的精子為靶細胞，通過計算機輔助精子分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｓｅｍｅｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＣＡＳＡ），對水體中的多種重金屬的毒性進行了研究，發現汞、錫、鉛、鎘和鋁等重金屬均能誘導精子細胞發生過氧化反應、降低精子活力和受精率，并影響子代的正常發育［４－１０］。到目前為止，人們更多關注鐵離子對哺乳動物和人類生殖毒性的研究［１１，１２］，尚未見對淡水魚精子細胞毒性的報道。我們首次應用ＣＡＳＡ技術來研究不同Fe2+濃度處理對泥鰍（Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ）精子運動參數的影響，為進一步了解Fe2+對淡水硬骨魚的生殖毒性作用及對水生態環境的影響提供理論依據。

１材料與方法

１．１實驗材料

實驗用泥鰍購于聊城市交運大市場，運回實驗室后，先在１０ ｍｇ／Ｌ的ＫＭｎＯ４溶液中浸泡１０ min殺菌消毒，在玻璃缸（６０ ｃｍ×２５ ｃｍ×３５ ｃｍ）內飼養兩周后用于實驗。實驗用水為曝氣３ ｄ以上的自來水，連續充氣，每天換約１／５體積的水。

１．２試劑與儀器

實驗用硫酸亞鐵（ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）、氯化鉀（ＫＣｌ）和氯化鈉（ＮａＣｌ）等化學試劑均為分析純，購買于南京南奧科技有限公司。實驗參照Ｍáｒｒｉáｎ等［１３］的方法并加以改進，用雙蒸水配制精子保存液和激活液母液。精子保存液母液含１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２和１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．５），滲透壓為３３０ ｍＯｓｍ／ｋｇ。精子激活液母液含６０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２和１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．５），滲透壓為１５０ ｍＯｓｍ／ｋｇ。分別用保存液和激活液母液配制Ｆｅ２＋終濃度為３０、６０和３００ μｍｏｌ／Ｌ的保存液和激活液。

１．３精子的收集與處理

取健康的性成熟泥鰍，先在清水中沖洗，然后用吸水紙吸去魚體表面的水。稱重和測體長后，解剖取精巢。實驗用魚的平均體重是（８．６２±０．５４）ｇ，平均體長為（１２．８８±０．４４）ｃｍ，精巢平均重量（０．０６３ ２± ０．００２ ８）ｇ。按１∶１０（Ｗ∶Ｖ，g∶mL）將精巢放在保存液中，用眼科剪剪碎，讓精液溢出，然后離心１ ｍｉｎ（２００ ｒ／ｍｉｎ），棄去組織碎塊加入少量保存液、計數，制成精子懸液（密度約為１０７個／ｍＬ）。按實驗設計暴露０、０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后檢測精子運動參數。

１．４精子運動參數檢測

分別取５ μＬ精子懸液，置于干凈載玻片上，迅速用４５ μＬ相應濃度的鐵離子激活液混合，混合１０ ｓ后，精子已被充分激活。在光學顯微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１，Ｊａｐａｎ）下觀察（×４００）和記錄精子運動參數。①精子運動時間：從激活開始，到精子運動百分數減少到２０％時所用的時間；②精子運動百分數：同一視野中，運動精子數與全體精子總數的百分比；③精子運動速度：精子細胞位移與時間比；④相對平均速度：不同濃度處理的精子運動速度與對照組精子速度的比。精子激活后每隔１ ｍｉｎ記錄一次運動百分數，并拍攝。每組實驗至少重復３次，每次隨機選擇３個視野，在對照組中，最大精子運動百分數低于９０％的精子懸液樣本，不作記錄。

１．５統計分析

所得數據以平均值±標準差表示，用Ｅｘｃｅｌ和ＳＰＳＳ １３．０統計軟件進行分析，采用ｔ檢驗進行差異顯著性檢驗，顯著差異水平為Ｐ＜０．０５。

２結果

２．１不同Ｆｅ２＋濃度對泥鰍精子運動百分數的影響

在對照組中，精子運動百分數是９５％，暴露２.0和４.0 ｈ后激活，精子運動百分數分別是９５％和９０％。在６０ μｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ２＋溶液中暴露１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，泥鰍精子的運動百分數分別為９２％、９０％和８６％；在３００ μｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ２＋溶液中激活，運動百分數是９１％，暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，運動百分數分別變為９０％、８６％、８５％和６５％。由圖１知，Ｆｅ２＋對泥鰍精子運動百分數影響較小，僅在高濃度組（３００ μｍｏｌ／Ｌ）出現顯著差異；隨暴露時間的延長，精子運動百分數在４.0 ｈ（６０ μｍｏｌ／Ｌ暴露組）時出現明顯降低。

２．２不同Ｆｅ２＋濃度對泥鰍精子運動時間的影響

在對照組中，泥鰍精子運動時間為３３０ ｓ；暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，精子運動時間分別為３６０、３２５、３１８和２９５ ｓ。在３０ μｍｏｌ／Ｌ Ｆｅ２＋溶液中的運動時間是３１６ ｓ，暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，分別是３０８、２８５、２８０和２７０ ｓ。在６０ μｍｏｌ／Ｌ Ｆｅ２＋的溶液中的運動時間是２７０ ｓ，暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，分別是２７５、２６５、２４０和２５８ ｓ。在３００ μｍｏｌ／Ｌ Ｆｅ２＋的溶液中的運動時間是２５５ ｓ，暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，分別是２５９、２３３、２３８和１８５ ｓ。由圖２可知，隨暴露濃度的升高，泥鰍精子運動時間呈縮短趨勢，并隨暴露時間的延長而縮短。

２．３不同Ｆｅ２＋濃度對泥鰍精子運動相對速度的影響

由圖３可知，在所有暴露時間中，６０和３００ μｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ２＋明顯降低了泥鰍精子的相對速度，并隨著暴露濃度的增高而顯著降低；而３０ μｍｏｌ／Ｌ Ｆｅ２＋僅在暴露４.0 ｈ后對相對速度影響明顯。在２.0 ｈ的暴露時間內，所有實驗組泥鰍精子的相對速度沒有發生明顯變化；但當暴露時間延長到４.0 ｈ時，經Ｆｅ２＋暴露的所有泥鰍精子的相對速度顯著降低。

３討論

一般認為，重金屬對動物的毒性作用與細胞質膜過氧化有關。機體內的鐵主要以化合物的形式存在，當體內游離的鐵過量時，會通過Ｆｅｎｔｏｎ反應產生氧自由基［１４，１５］，過量的自由基不僅會損傷蛋白質、脂質和ＤＮＡ等生物大分子［１６，１７］，還對線粒體進行攻擊。在本研究中，６０ μｍｏｌ／Ｌ及以上濃度的Ｆｅ２＋溶液明顯影響了泥鰍精子的運動時間和速度。精子運動速度和持續時間的長短，是影響受精率的重要參數。可見，Ｆｅ２＋對泥鰍精子具有生殖毒性。暴露時間較短時，低濃度組精子各運動參數的變化較小，４.0 ｈ后精子運動能力才明顯降低。可見在短時間內，低濃度Ｆｅ２＋的毒性是較弱的。在暴露０．５ ｈ時，泥鰍精子表現出最強的活力，其產生原因及對受精和發育的影響有待進一步研究。

《煤炭工業污染物的排放標準》中對鐵的要求是低于１２５ μｍｏｌ／Ｌ（７ ｍｇ／Ｌ），高于我們研究中顯著影響精子運動能力的濃度。工業廢水在沒有經過進一步處理直接排入河流和湖泊時，處于排放口附近的魚類的生殖和發育很可能會受到嚴重的影響。近期，劉時東［１８］對河南某礦井調查時發現，當地礦井排放的廢水中鐵離子濃度嚴重超標（達１１ ６００ μｍｏｌ／Ｌ），已使湄水河受到嚴重污染。

總之，過量的Ｆｅ２＋能降低泥鰍精子的運動能力，對泥鰍的生殖具有潛在的毒性作用。因此，Ｆｅ２＋對水環境的污染和其潛在的生殖毒性需要引起人們足夠重視和關注，其對淡水硬骨魚精子細胞的毒性作用機制更需深入研究。

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