豬體細胞克隆技術研究進展

摘要：克隆不僅可以保護瀕危動物，而且與干細胞工程技術結合應用于克隆性治療，具有重大的科學意義和應用價值。體細胞克隆豬因其在人類器官移植方面具有巨大的應用潛力，已成為當今研究的熱點，但是體細胞核移植技術仍存在許多問題，其中最主要的是體細胞核移植的環節多，克隆效率低。對體細胞克隆豬的關鍵環節，即供核細胞、卵母細胞、顯微操作、克隆胚的激活、培養及移植技術進行了簡要綜述。

關鍵詞：豬；克隆；顯微操作；激活；重構胚

中圖分類號：Ｓ８２８；Ｑ８１３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1309-04

Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｐｉｇ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ＨＵＡ Ｚａｉ－ｄｏｎｇ１，ＷＥＩ Ｑｉｎｇ－ｘｉｎ２，ＺＨＥＮＧ Ｘｉｎ－ｍｉｎ２，ＱＩＡＯ Ｘｉａｎ－ｆｅｎｇ２，ＸＵ Ｈｏｕ－ｑｉａｎｇ１

（１． Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｌｏｎｉｎｇ ｃould ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ endangered ａｎｉｍａｌｓ， ｂｕｔ ａｌｓｏ be ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｌｏｎｉｎｇ ｗｈｅｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. Thus ｉｔ ｈａｓ ｇｒｅａｔ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ practical ｖａｌｕｅ． Ａｓ ｐｉｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｌｏｎｉｎｇ ｈａｓ ｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｐｅｃｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｒｇａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ｉｔ ｎｏｗ ｂｅｃｏｍｅs ａ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｆｏｃｕｓ． However， tｈｅｒｅ ａｒｅ ｓｔｉｌｌ ｍａｎｙ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｉｅｓ， ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｏｏ ｍａｎｙ ｓｔｅｐｓ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｌｏｎｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ， ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｏｏｃｙｔｅｓ， ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ， ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｓｅｖｅｒａｌ ｋｅｙ ｓｔｅｐｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｐｉｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｉｇ； ｃｌｏｎｉｎｇ； ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ； ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ； ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏ

體細胞克隆是將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經精子穿透等有性過程即被激活、分裂并發育，讓核供體的基因得到完全復制， 經過體外培養后，將發育良好的胚胎移植到動物體內的技術。近年來，由于豬的體細胞克隆在建立動物疾病模型、進行基因工程藥物生產和臨床醫學克隆治療等方面具有優勢，因而成為當今克隆領域的熱點。

１國內外體細胞克隆技術研究的現狀

哺乳動物細胞核移植研究經歷時間不長，以１９９７年英國Ｒｏｓｌｉｎ研究所Ｗｉｌｍｕｔ等［１］克隆多利羊的誕生為標志，揭開了體細胞核移植的序幕。１９９８年，Ｗａｋａｙａｍａ等［２］用顆粒細胞作供核細胞克隆出了小鼠。同年，Ｃｉｂｅｌｌｉ等［３］得到第一頭體細胞轉基因牛。相對而言，豬的體細胞克隆研究進展較慢，直到２０００年，Ｐｏｌｅｊａｅｖａ等［４］才獲得首例體細胞克隆豬。２００３年，Ｈｙｕｎ等［５］克隆出了表達強熒光蛋白的轉基因豬。Ｒａｍｓｏｏｎｄａｒ等［６］克隆出了敲除α－１，α－２半乳糖苷轉移酶基因的克隆豬，人類培育異種器官移植豬跨進了一大步。２００８年，Ｔａｂａｒ等［７］利用來自于帕金森小鼠模型的體細胞，通過核移植方法獲得了胚胎干細胞系，然后通過體外定向分化與體內移植，使小鼠的病癥得到緩解。同時也表明，胚胎干細胞與核移植技術相結合為一些疑難疾病提供了新的治療手段。在國內，２００３年西北農林科技大學馮秀亮等［８］得到了人體細胞和豬卵母細胞異種核移植囊胚。２００５年８月中國農業大學李寧教授課題組獲得我國第一頭體細胞克隆豬，我國也成為世界第七個獲得豬體細胞克隆后代的國家。

２豬體細胞核移植的關鍵技術

２．１供核細胞

２．１．１供核細胞的類型目前體細胞克隆豬中采用多種供核細胞，如胎兒成纖維細胞、顆粒細胞及成體成纖維細胞等。Ｌｅｅ等［９］比較了豬胎兒成纖維細胞、顆粒細胞、輸卵管上皮細胞作為供體細胞構建重組胚發育到囊胚的能力，結果顯示胎兒成纖維細胞效果最好。筆者認為胎兒成纖維細胞的效果較好，可能是因為胎兒成纖維細胞為未分化細胞，易于在胞質中重新啟動核編程。

２．１．２供核細胞的時期供核細胞的Ｇ０、Ｇ１期細胞對克隆效率產生影響。多利羊來源于血清饑餓后處于Ｇ０期的細胞，但之后許多克隆動物都來源于未經饑餓處理的生長期細胞。許多學者對血清饑餓誘導細胞進入Ｇ０期的必要性持否定態度，他們認為處于靜止期和生長期的細胞均能在核移植后被程序化并能獲得克隆后代。２００１年，Ｌａｉ等［１０］選擇Ｇ２／Ｍ期的細胞作為供核細胞獲得了體細胞克隆豬。從目前研究狀況可以看出，Ｇ０期或Ｇ２／Ｍ期的供核細胞都能有效地在胞質受體中進行正常核編程。然而，Ｆｉｏｒｅｔｔｉ等［１１］認為沒有一種伴隨核移植動物出生的細胞周期專一性標記證明核移植的后代來源于某一特定時期。因此，關于供核細胞周期的選擇仍然沒有很清楚的認識，還需要繼續深入研究。

２．２卵母細胞

２．２．１來源成熟卵母細胞來源主要有體內和體外兩種途徑。Ｌｅｅ等［１２］比較了兩種來源的卵母細胞發育情況，孤雌激活后體內成熟的卵母細胞卵裂率和囊胚率比體外成熟的卵母細胞高。Ｈｙｕｎ等［１３］研究發現從經產母豬獲得卵母細胞無論在成熟率還是在體外發育能力方面都比從未產母豬獲得的卵母細胞好。相對豬體內成熟的卵母細胞來說，體外成熟的卵母細胞來源豐富，價格低廉，因而已成為體外受精、克隆研究的主流。但目前豬卵母細胞體外成熟系統還不完善，體外成熟培養時間較長，許多理化因素直接或間接地影響著卵母細胞的體外成熟及后來的發育。

２．２．２體外培養豬卵母細胞的體外成熟與培養條件和培養液密切相關。現在普遍采用改良的ＴＣＭ１９９［１４，１５］和ＮＣＳＵ－２３［１６］兩種成熟培養基。本實驗室通過大量試驗，改良ＴＣＭ１９９為卵母細胞成熟培養，選擇ＮＣＳＵ－２３＋４ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ為胚胎培養獲得了比較理想的效果。根據相關研究［１７］，豬卵母細胞的體外成熟與卵巢上卵泡大小有關。豬卵泡直徑只有達到２ ｍｍ以上，其卵母細胞才具備體外成熟的能力，小卵泡中的卵母細胞缺乏進一步發育所需的相關因子，獲得的卵母細胞體外成熟率較低，不適合于體外成熟培養。卵泡直徑大于６ ｍｍ的卵母細胞在體外培養時退化嚴重，可能與其老化有關。所以，用于體外培養的卵母細胞取３～６ ｍｍ直徑的卵泡最有利于成熟。卵母細胞體外培養時間對其發育影響也很大。本實驗室發現２４ ｈ成熟的卵母細胞與４２ ｈ成熟的卵母細胞相比，其卵裂率和囊胚率差異極顯著。此外，卵母細胞所處的成熟時期與盲吸去核的質量和效率密切相關，成熟的好壞直接影響著克隆胚胎能否最終發育成正常個體，以第一極體（ＰＢⅠ）為標志的盲吸去核法，培養時間過長，卵齡增加使第一極體與中期染色體的位置發生偏轉；培養時間太短，則胞質和核成熟不徹底，去核效率低。因此，一般選擇成熟培養４０～４４ ｈ的卵母細胞作為胞質受體。

２．３顯微操作

顯微操作主要由去核和注核兩部分組成，對體細胞克隆效率有著決定性的影響。如果去核不完全，則導致克隆胚染色體不完整，造成卵裂異常，影響克隆胚的發育；如果胞質丟失過多，則不能進行有效的核重新編程。顯微操作存在著技術要求高、耗費時間長、對細胞損傷大的缺點。為了完善這一技術，人們不斷地從各個角度進行探索，如采用化學誘導去核法、手工克隆（Ｈａｎｄｍａｄｅ ｃｌｏｎｇ，ＨＭＣ）技術等等。２００７年，Ｄｕ等［１８］利用ＨＭＣ技術成功得到體細胞克隆豬。ＨＭＣ簡化核移植程序，有可能代替傳統技術來大規模生產哺乳動物胚胎，進而推進體細胞核移植胚胎的商業化。

２．３．１去核方法去核即去除卵母細胞內核遺傳物質。一般有以下幾種方法，①活性熒光染料（Ｈｏｅｃｈｅｓ３３３４２）定位法，該方法去核準確，但染料和紫外線對卵母細胞有毒害作用，所以去核時間不能過長；②盲吸法，這種方法存在著技術要求高、耗費時間長、對卵母細胞損傷嚴重、影響細胞質空間結構等缺點；③點壓法，因去核時只需輕輕點擊透明帶，即可除去第一極連同少量細胞質，對卵母細胞質損傷較小，同時去核時不用換針，從而能有效提高去核效率；④化學誘導去核法，是用脫羰秋水仙堿（Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）處理激活的ＭＩＩ期卵母細胞，使其排出第二極體。由于脫羰秋水仙堿的作用，核染色質沒有分開而全部進入排出的第二極體，從而完成去核；⑤紡錘體探測技術，是利用ＭＩＩ期卵母細胞的細胞質和紡綞體對光的不同折射率，在顯微鏡光學系統上附加在極性光學顯微鏡基礎上研制出的一種紡綞體圖像觀察系統——Ｓｐｉｎｄｌｅ－ｖｉｅｗ偏振光系統，將該系統捕獲的圖像進行計算機處理，顯示出ＭＩＩ期染色體所處位置，然后通過顯微操作法去核，用該方法可以對ＭＩＩ期的卵母細胞進行準確去核。這一方法可有效用于小鼠、倉鼠、牛和人卵母細胞的去核［１９］。由于豬卵母細胞的脂肪滴太多，在此系統下不能長時間觀察到紡錘體，但現在通過改進已有實驗室應用。

２．３．２注核方法注核一般分為胞質內注射和透明帶下注射。胞質內注射一般用Pｉｅｚｏ－ａｃｔｕａｔｉｏｎ（壓電－陶瓷系統）微注射系統，直接把供體核注入胞質內。透明帶下注射則把整個供核細胞注射至卵周隙，并需要融合。目前也有研究者直接把整個供核細胞注入胞質內，不需要融合而且效果非常好，其囊胚形成率達３７％［２０］。這可能是：①移入的供核細胞的細胞膜會逐漸在胞質受體中消失；②這樣做不需要進行融合，減少了體外操作時間；③移入的胞質成分也許對重構胚的進一步發育很重要；④確保了ＤＮＡ能完全進入去核的卵母細胞，避免了獲得供體核過程中對其結構的損壞，能更有效地支持重組胚的發育。當然，Ｐｅｕｒａ等［２１］采用與傳統顯微操作程序相反的方法，利用去除透明帶的綿羊卵母細胞，先融合外來核，然后再去掉卵母細胞核，獲得較好的結果，而且大大縮短了體外操作時間。在顯微操作方面目前已有許多科研工作者嘗試著一些新的方法，這些方法主要是減少操作強度和難度，從而讓更多的科研工作者更易進入這個領域。

２．４融合

最早是使用仙臺病毒融合方法［２２］，但效果很不穩定而且毒性大。Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ［２３］在１９８６年利用胚胎細胞克隆羊試驗中采用的直流電介導融合的方法，簡便而且高效，目前已廣泛使用。由于試驗者技術方法以及設備的原因，操作過程中容易引起卵的活化，尤其是融合過程中的電擊，在細胞膜外鈣離子進入和細胞內鈣離子釋放的情況下，極易在融合的過程中使大部分卵激活，縮短了體細胞重新編程的時間，使克隆的效率下降，因此目前核移植融合中多采用降低或去除鈣離子的融合液。此外，去核后的卵母細胞卵周隙變大，與供體細胞的接觸面變小，質膜無法緊密接觸，無法融合，是導致融合率下降的重要原因。

２．５激活

許多哺乳動物排出的卵母細胞都停留在ＭＩＩ 期直至受精激活或人工誘導激活才完成第二次成熟分裂。體內排出的卵母細胞停滯在ＭＩＩ期是由于持續高水平的成熟促進因子（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｒ ｍ－ｐｈａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＭＰＦ）或細胞靜止因子（Ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＣＳＦ）所致。ＭＰＦ的活性是由對Ｃａ２＋非常敏感的ＣＳＦ來維持的。升高的Ｃａ２＋破壞了已存在的ＣＳＦ，從而導致ＭＰＦ活性降低。ＭＰＦ水平下降或消失，就會引起卵子活化，促使卵母細胞離開ＭＩＩ 期，完成減數分裂并進行孤雌發育。卵母細胞的激活主要有物理和化學兩種方法。

２．５．１物理激活物理激活包括機械刺激、溫度變化和電激活等，但應用較多的是電刺激法，由于它模擬了精子受精時鈣離子瞬時升高的原理，效果比較好。對豬而言，一般電刺激參數為ＤＣ（直流電）：１．０～１．５ ｋＶ／ｃｍ，１次脈沖，６０ μｓ或１．３ ｋＶ／ｃｍ，２次脈沖，６０ μｓ。豬卵母細胞的激活從眾多文獻及個人試驗選擇ＤＣ：１．５ ｋＶ／ｃｍ，１次脈沖，６０ μｓ，在此前后給予一個１０ Ｖ，５ ｓ的交流電能得到比較好的效果。

２．５．２化學激活化學激活方法則有很多種，如注射鈣離子緩沖液，用８％乙醇處理１０ ｍｉｎ或用鈣離子載體Ａ２３１８７處理。近來，很多學者使用離子霉素（Ｉｎｏｍｙｃｉｎ，Ｉｎｏ）進行激活，因為離子霉素是一種高效的鈣離子載體，可動員細胞的Ｃａ２＋釋放，并依次觸發后期Ｃａ２＋的內流，引起細胞內的Ｃａ２＋升高和卵母細胞的激活。單一使用Ｉｎｏ可以激活卵母細胞，但排出ＰＢⅡ后染色體濃縮，很少形成二倍體的原核，因此，它通常與二甲基氨基嘌呤（６－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ，６－ＤＭＡＰ），放線菌酮（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ，ＣＨＸ）或焦磷酸鈉（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＳＰＰ） 配合使用。

２．６克隆胚的培養

Ｂｒｉｎｓｔｅｒ于１９６３年用液體石蠟覆蓋微滴培養（簡稱微滴法）獲得成功［２４］。目前，微滴培養是應用最廣泛的一種胚胎培養系統。該法在豬卵母細胞體外培養中已得到廣泛使用，但礦物油是否對卵母細胞體外成熟產生影響依然存在爭議。趙永貞等［２５］采用套皿法替代礦物油微滴培養法進行小鼠胚胎培養，獲得了成功。本實驗室經過改良，將５孔細胞培養板放入套皿內培養豬卵母細胞，獲得了較高的成熟率（８２％）。此法無需使用礦物油，是一種新的培養方法，既繼承了微滴法培養的優點，又節約成本，還排除了因礦物油質量產生的潛在影響。

３應用前景

體細胞核移植技術在拯救珍稀瀕危動物、進行異體器官移植、應用在克隆性治療上及生產藥用蛋白等方面，具有廣闊的應用前景，尤其與基因工程、干細胞技術結合無疑會對自然界及人類社會產生極其深遠的影響。由于克隆豬的成功，異體移植及急性排斥問題有望得到解決。豬的器官大小、形狀及生理特點等方面與人的器官非常相似，所以人們把豬看作理想的異體器官移植供體。克隆豬的成功預示著可以利用基因靶位操作技術對豬的基因組進行修飾和改變，如果將α－１，３-半乳糖苷酶的基因敲除或經過修飾去除其免疫原性的話，急性排斥問題就可以被有效解決，異體器官移植也有可能成功。另外，利用體細胞的克隆胚囊胚，分離出類干細胞，再經過特殊的誘導將類干細胞培育成不同的細胞、組織和器官。這樣就能為病人提供沒有排斥反應的細胞、組織和器官。因此，治療性克隆是核移植技術的潛在應用，這一技術將會顯示出巨大潛力。

盡管在體細胞克隆豬的研究上取得了許多成績，但是總體來說不太理想。最近１０年間，就其技術本身并沒有多大改善，胚胎發育機制及調控等基礎性問題知之甚少，成功率只能達到１%～２％，還值得深入研究。另外，對克隆動物與正常胚胎的發育有何異同及以后表現是否正常這些問題的解決，將有助于加深人們對動物胚胎發育的過程中分子機制的認識。因此，今后應該著重于有關核重新編程分子機制以及胞質線粒體的影響等研究。

參考文獻：

［１］ ＷＩＬＭＵＴ Ｉ，ＳＣＨＮＩＥＫＥ Ａ Ｅ，ＭＣＷＨＩＲ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｖｉａｂｌｅ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｆｅｔａｌ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９７，３８５：３１０－３１８．

［２］ ＷＡＫＡＹＡＭＡ Ｔ，ＰＥＲＲＹ Ａ Ｃ Ｆ， ＺＵＣＣＯＴＴＩ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｆｕｌｌ－ｔｅｒｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｅｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｏｃｙｔｅｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｕｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｉ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４（２３）：３６９－３７４．

［３］ ＣＩＢＥＬＬＩ Ｊ Ｂ，ＳＴＩＣＥ Ｓ Ｌ，ＧＯＬＵＥＫＥ Ｐ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｃａｌｖｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｎｏｎｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８０：１２５６－１２５８．

［４］ ＰＯＬＥＪＡＥＶＡ Ｉ Ａ，ＣＨＥＮ Ｓ Ｈ，ＶＡＵＧＨＴ Ｔ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４０７：８６－９０．

［５］ ＨＹＵＮ Ｓ，ＬＥＥ Ｇ，ＫＩＭ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｉｇｌｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｒｃｉｎｅ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００３， ６９：１０６０－１０６８．

［６］ ＲＡＭＳＯＯＮＤＡＲ Ｊ Ｊ，ＭＡＣＨ?魣ＴＹ Ｚ，ＣＯＳＴＡ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ １，３－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ １，２－ｆｕｃｏｓｙｌｏｓｙｌ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００３，６９：４３７－４４５．

［７］ ＴＡＢＡＲ Ｖ，ＴＯＭＩＳＨＩＭＡ Ｍ，ＰＡＮＡＧＩＯＴＡＫＯＳ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００８，１４（４）：３７９－３８１．

［８］ 馮秀亮，雷安民，楊春榮，等． 異種動物細胞核移植研究現狀及相關問題的探討［Ｊ］． 西北農林科技大學學報，２００３，３１（４）：７８－８２．

［９］ ＬＥＥ Ｊ Ｗ，ＴＩＡＮ Ｘ Ｃ，ＹＡＮＧ Ｘ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔ ｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐ ｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，２００４，６８（１）：５１．

［１０］ ＬＡＩ Ｌ Ｘ，ＴＡＯ Ｔ，ＭＡＣＨ?魣ＴＹ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐｏｒｃｉｎｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｇ２／Ｍ ｓｔａｇｅ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｓ ｄｏｎｏｒｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００１，６５：１５５８－１５６４．

［１１］ ＦＩＯＲＥＴＴＩ Ａ Ｍ，ＬＡＮＺＡ Ｒ． Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｐａｌａｅｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｄｅｖｏｎｏ－Ｃａｒｂｏｎｉｆｅｒｏｕｓ Ａｄｍｉｒａｌｔｙ ｉｎｔｒｕｓｉｖｅｓ［Ｊ］． Ｔｅｒｒａ Ａｎｔａｒｔｉｃａ，２０００，７（５）：６５７－６６４．

［１２］ ＬＥＥ Ｇ Ｓ，ＨＹＵＮ Ｓ Ｈ，ＫＩＭ Ｈ Ｓ，ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｂｙ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｏｏｃｙｔｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００３，５９：１９４９－１９５７．

［１３］ ＨＹＵＮ Ｓ Ｈ，ＬＥＥ Ｇ Ｓ，ＫＩＭ Ｄ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｏｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｗｓ ｏｒ ｇｉｌｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇ ｅｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００３，５９：１６４１－１６４９．

［１４］ ＦＵＮＡＨＡＳＨＩ，ＤＡＹ Ｂ Ｎ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｒｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｏｎ ｍｅｉｏｔｉｃ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇ ｏｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３９：９６５－９７３．

［１５］ ＭＡＴＴＩＯＬＩ Ｍ，ＢＡＣＣＩ Ｍ Ｌ，ＧＡＬＥＡＴＩ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｏｆ ｐｉｇ ｏｏｃｙｔｅｓ ｍａｔｕｒｅｄ ａｎｄ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，１９８９，３１：１２０１－１２０７．

［１６］ ＦＵＮＡＨＡＳＨＩ Ｈ，ＫＩＭ Ｎ Ｈ，ＳＴＵＭＰＦ Ｔ Ｔ. Ｃａｎｔｌｅｙ ａｎｄ ｄａｙ ＢＮ． ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｏｓｍｏｌｙｔｅｓ ｉｎ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇ ｏｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１９９６，５４：１４１２－１４１９．

［１７］ ＹＯＯＮ Ｋ Ｗ，ＳＨＩＮ Ｔ Ｙ，ＰＡＲＫ Ｊ Ｉ，ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｅｏｖｕｌａｔｏｒｙ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｚｅｓ ａｆｔｅｒ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｄｉａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄｓ［Ｊ］． Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ，２０００，１２（３－４）：１３３－１３９．

［１８］ ＤＵ Ｙ，ＫＲＡＧＨ Ｐ Ｍ，ＺＨＡＮＧ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｐｉｇｌｅｔｓ ｂｏｒｎ ｆｒｏｍ ｈａｎｄｍａｄｅ ｃｌｏｎｉｎｇ， ａｎ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００７，６８：１１０４－１１１０．

［１９］ ＬＩＵ Ｌ，ＯＬＤＥＮＢＯＵＲＧ Ｒ，ＴＲＩＭＡＲＣＨＩ Ｊ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ａ Ｒｅｌｉａｂｌｅ， ｎｏｎｉｖａｓｉｖｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｓｐｉｎｄｌｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｏｏｃｙｔｅｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２０００，１８：２２３－２２５．

［２０］ ＪＡＮＧ－ＷＯＮ Ｌ Ｅ Ｅ，ＳＨＩ－ＣＨＩＨ Ｗ Ｕ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓ ｂｙ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００３，６９：９９５－１００１．

［２１］ ＰＥＵＲＡ Ｔ Ｔ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｓｈｅｅｐ ｓｏｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ－ｏｒｄｅｒ ｚｏｎａ－ｆｒｅｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２００３，５：１３－２４．

［２２］ ＬＩＮ Ｔ Ｐ，ＦＬＯＲＥＮＣＥ Ｊ． Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ ｏｆ ｍｏｕｓ ｅｇｇｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９７３，２４２（５３９２）：４７－４９．

［２３］ ＷＩＬＬＡＤＳＥＮ Ｓ Ｍ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｅｅｐｅ ｍｂｒｙｏｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２０（６０５７）：６３－６５．

［２４］ ＢＲＩＮＳＴＥＲ Ｒ Ｌ． Ａ ｍｅｒｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｕｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｏｖａ ｆｒｏｍ ｔｏｗ－ｃｅｌｌ ｔｏ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ［Ｊ］． Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，１９６３，３２（１）：２０５－２０８．

［２５］ 趙永貞， 鄭新民， 曹斌云， 等． 一種早期胚胎培養方法的建立［Ｊ］． 遺傳，２００４，２６（３）：３６４－３６６．