低溫處理后不同竹種cDＮA分子水平上的變化和聚類分析

摘要：以慈竹和硬頭黃竹等１２個竹種為材料，采用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法，研究低溫脅迫后不同竹種ｃＤＮＡ分子水平上的變化。結果是低溫處理后，不同竹種的ｃＤＮＡ經不同引物擴增后，其ＲＡＰＤ－ＰＣＲ譜帶的變化出現(xiàn)４種類型，即有的竹種出現(xiàn)原有ＲＡＰＤ－ＰＣＲ譜帶的缺失、新譜帶的出現(xiàn)以及原有譜帶強度的增強和減弱，有的竹種ＲＡＰＤ－ＰＣＲ譜帶未發(fā)生改變，這表明低溫處理后不同竹種在分子水平上確實發(fā)生了變化，這種變化與低溫脅迫有關，且因竹種而異。

關鍵詞：竹；低溫脅迫；ｃＤＮＡ水平變化；聚類分析

中圖分類號：Ｓ７９５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）07－1484-04

Variation and Clustering Analysis about cDNA of Bamboo Treated by Cold

ＨＵ Ｓｈａｎｇ－ｌｉａｎ１，ＣＡＯ Ｙｉｎｇ１，ＤＵＡＮ Ｎｉｎｇ１，ＬI Ｙｉ１，ＣＨＥＮ Ｑｉ－ｂｉｎｇ２，ＬＵ Ｘｕｅ－ｑｉｎ１，ＪＩＡＮＧ Ｙａｏ１，２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉａｎｙａｎｇ ６２１０１０，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ’ａｎ ６２５０１４，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＲＡＰＤ－ＰＣＲ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｗｅｌｖｅ ｂａｍｂｏｏ ｓｐｅｃｉｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｎｅｏｓｉｎｏｃａｌａｍｕｓ ａｆｆｉｎｉｓ ａｎｄ Ｂａｍｂｕｓａ ｒｉｇｉｄａ ｅｃｔ．， ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＲＡＰＤ－ＰＣＲ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｏ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｎｅｗ ｏｆ ＲＡＰＤ－ＰＣＲ ｂａｎｄｓ， ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ ｏｒ ｗｅａｋｅｎｉｎｇ ｏｆ ＲＡＰＤ－ＰＣＲ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｎｏ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＲＡＰＤ－ＰＣＲ ｂａｎｄｓ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｓｏｍｅ ｓｐｅｃｉｅｓ． Ｔｈｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＲＡＰＤ－ＰＣＲ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｍｂｏｏ ｓｐｅｃｉｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂａｍｂｏｏ；ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ；ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃＤＮＡ；ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ

在低溫脅迫下植物體內的可溶性糖［１］、可溶性蛋白質和游離脯氨酸、保護酶活性［２］等常發(fā)生變化。以往對竹子抗寒性的研究，主要集中在自然條件下與竹子抗寒性有關的生理生化指標的分析上［３－６］，而分子水平的變化鮮見報道，本文以慈竹、硬頭黃竹等１２種竹子為材料，采用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技術，研究低溫脅迫后不同竹種ｃＤＮＡ水平上的變化，為竹子抗寒機制的研究提供理論依據。

１材料與方法

１．１材料

供試材料采自四川青神竹藝城，分別為慈竹（Ｎｅｏｓｉｎｏｃａｌａｍｕｓ ａｆｆｉｎｉｓ，以ＣＺ表示）、硬頭黃竹（Ｂａｍｂｕｓａ ｒｉｇｄａ，以ＹＴＨ表示）、小琴絲竹（Ｂａｍｂｕｓａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｖａｒ． ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｃｖ． Ａｌｐｈｏｎｓｅ－Ｋａｒｒ，以ＸＱＳＺ表示）、青皮竹（Ｂａｍｂｕｓａ ｔｅｘｔｉｌｉｓ ＭｃＣｌｕｒｅ，以ＱＤＺ表示）、粉單竹（Ｂａｍｂｕｓａ ｃｈｕｎｇｉｉ ＭｃＣｌｕｒ，以ＦＤＺ表示）、釣魚竹（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｎｉｇｒａ ｖａｒ． ｈｅｎｏｎｉｓ Ｓｔａｐｆ． ｅｘ Ｒｅｎｄｌｅ，以ＤＹＺ表示）、羅漢竹（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ａｕｒｅａ Ｃａｒｒ．ｅｘ Ａ． ａｎｄ Ｃ．Ｒｉｖｉｅｒｅ，以ＬＨＺ表示）、鳳尾竹（Ｂａｍｂｕｓａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｃｖ． Ｆｅｒｎｌｅａｆ，以ＤＦＷＺ表示）、斑竹（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅｓ ｆ． ｌａｃｒｉｍａ－ｄｅａｅ，以ＢＺ表示）、實心竹（Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｈｅｔｅｒｏｃｌａｄａ ｆ． ｓｏｌｉｄａ，以ＮＸＺ表示）、苦竹（Ｐｌｅｉｏｂｌａｓｔｕｓ ａｍａｒｕｓ，以ＫＺ表示）、巨竹（Ｄｅｎｄｒｏｃａｌａｍｕｓ ｙｕｎｎａｎｉｃｕｓ，以ＪＺ表示），共計１２種竹子。

１．２處理方法

選取長勢一致的枝條，將其剪成３０ ｃｍ長的枝段，洗凈擦干，石蠟封口，置于低溫冰箱中－１５℃處理１２ ｈ，每個樣品設置３次重復。處理后將葉片于液氮中速凍３０ ｍｉｎ后保存于－８０℃冰箱。將未處理的枝條葉片于液氮中速凍３０ ｍｉｎ后保存作為對照。

１．３不同竹種葉片總ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ的合成

１．３．１葉片總ＲＮＡ的提取將葉片置于液氮中迅速研磨，將研碎的粉末迅速轉入１．５ ｍＬ ＥＰ管中，加入Ｔｒｉｚｏｌ試劑，室溫下放置１０ ｍｉｎ；４℃ １１ ８００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ；取上清，加入２００ μＬ氯仿，劇烈混勻，室溫下放置１０ ｍｉｎ；４℃ １１ ４００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；取上清并加入５００ μＬ異丙醇，混勻后于４℃ １１ ４００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；去上清，７５％乙醇洗ＲＮＡ沉淀；干燥ＲＮＡ沉淀；加入ＤＥＰＣ處理水溶解ＲＮＡ。

１．３．２ｃＤＮＡ的合成ｃＤＮＡ合成反應由Ｑｉａｎｇｅｎ公司的Ｏｍｉｎｉｓｃｒｉｐｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｆｏｒ

ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ反轉錄試劑盒提供的試劑進行，擴增反應在Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰＣＲ自動擴增儀ＰＴＣ－２００上面進行，２０ μＬ擴增體系如表１所示。ＰＣＲ儀中３７℃恒溫６０ ｍｉｎ，取出產物，－２０℃條件下保存。

１．４ＲＡＰＤ引物

根據Ｗｕ等［７］設計的引物，由北京奧科生物技術有限責任公司合成（表２）。

１．５ＲＡＰＤ擴增

采用１８個ＲＡＰＤ引物對１２個不同竹種的ｃＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增。ＰＣＲ擴增反應體系（２０ μＬ）為：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．００ μＬ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ １．６０ μＬ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ １．６０ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ引物 ０．６０ μＬ，１００ ｎｇ／μＬ ｃＤＮＡ模板０．５０ μＬ，ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．１５ μＬ（大連寶生物工程有限公司），ｄｄＨ２Ｏ １３．５５ μＬ。ＰＣＲ擴增反應于Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰＣＲ自動擴增儀ＰＴＣ－２００中進行，同時測試了ＲＡＰＤ最佳退火溫度，經優(yōu)化的ＰＣＲ擴增程序為：９４℃預變性

３ ｍｉｎ；９４℃變性３０ ｓ，３６℃退火１ ｍｉｎ，７２℃延伸

２ ｍｉｎ，共４０個循環(huán)；７２℃完全延伸１０ ｍｉｎ。反應產物在含有ＥＢ的１．５％瓊脂糖凝膠中電泳檢測，以ＤＬ２０００的ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（大連寶生物工程有限公司）為分子量標記，在Ｂｉｏ－Ｒａｄ凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

１．６統(tǒng)計分析方法

ＲＡＰＤ為顯性標記，同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性，屬于同一位點的產物并按擴增陽性（１）和擴增陰性（０）手工記錄電泳譜帶，形成ＲＡＰＤ型數(shù)據矩陣用于進一步分析。用Ｐｏｐｇｅｎｅ３２（版本１．３２）計算遺傳數(shù)據［平均等位基因數(shù)（Ｎａ），有效等位基因數(shù)（Ｎｅ），Ｎｅｉ’ｓ基因多樣性（ｈ），Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ信息指數(shù)（Ｉ）］和Ｎｅｉ’ｓ無偏估計遺傳距離和遺傳一致度，通過非加權配對算術平均法（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ｍｅａｎ，ＵＰＧＭＡ）構建系統(tǒng)發(fā)生樹，并采用ＮＴＳＹＳ軟件繪制樹形圖。

２結果與分析

２．１低溫處理后不同竹種ｃＤＮＡ的變化

采用１８個引物對低溫處理后的１２個竹種的ｃＤＮＡ進行擴增，經ＲＡＰＤ－ＰＣＲ擴增后，共擴增出１４９條譜帶，其中多態(tài)性條帶１４７條，其多態(tài)性達９８．６６％，相當于每條引物平均擴增出８．２條譜帶，對這些譜帶進行分析，發(fā)現(xiàn)低溫處理后不同竹種的ｃＤＮＡ的ＲＡＰＤ－ＰＣＲ譜帶與未經處理的對照相比出現(xiàn)了以下４種變化類型。

第一種類型是對照中原有的ＲＡＰＤ－ＰＣＲ譜帶經過低溫處理后消失。如圖１Ｂ中１３泳道為斑竹對照（ＢＺ－Ｃ），１４泳道為低溫處理（ＢＺ－Ｔ），其經引物ＯＰＢ－０７對ｃＤＮＡ擴增后，對照原有分子量為１ １００ ｂｐ的譜帶在低溫處理后消失。

第二種類型是經過低溫處理后出現(xiàn)了新的譜帶。圖１Ａ中低溫處理后的斑竹ｃＤＮＡ，經引物ＯＰＹ－１５擴增后出現(xiàn)了一條分子量為５２３ ｂｐ的新譜帶（第２泳道）；圖１Ａ中低溫處理后的苦竹ｃＤＮＡ經ＯＰＹ－１５擴增后出現(xiàn)了４９２、９２０和１ ５８０ ｂｐ新譜帶（第８泳道）；圖１Ｂ中低溫處理后的小琴絲竹ｃＤＮＡ，經引物ＯＰＢ－０７擴增后出現(xiàn)了４條分子量分別為２５０、５０２、６１０和１ ８２６ ｂｐ的新譜帶（第２泳道）。

第三種類型是處理后的條帶比對照條帶強度增強或減弱。圖１Ａ中低溫處理后的實心竹ｃＤＮＡ經引物ＯＰＹ－１５擴增后分子量為１ ４９６ ｂｐ和１ ７８９ ｂｐ的譜帶強度比未經處理的對照減弱（５、６泳道）；圖１Ｂ中釣魚竹經低溫處理后，其ｃＤＮＡ經引物ＯＰＢ－０７擴增后分子量為７４２ ｂｐ的譜帶強度比未經處理對照的增強（５、６泳道）。

第四種類型是對照和處理的條帶未發(fā)生明顯變化。如圖１Ａ中巨竹（９、１０泳道）。

２．２低溫處理前后１２個不同竹種間的聚類分析

采用ＵＰＧＭＡ方法對低溫處理前和處理后的各竹種構建了ＲＡＰＤ系統(tǒng)樹如圖２。低溫處理前和處理后都將１２個竹種分為３個大類群。

低溫處理前，類群Ⅰ由３個系組成：釣魚竹與羅漢竹先聚類為一個系；小琴絲竹與鳳尾竹聚類為一個系；青皮竹與慈竹聚為一個系。類群Ⅱ由斑竹和苦竹組成；類群Ⅲ由３個系組成：硬頭黃與實心竹先聚類，再與粉單竹聚類，然后與巨竹聚類。其中類群Ⅰ和類群Ⅱ的關系比較近。

低溫處理后，類群Ⅰ也由３個系組成：釣魚竹與羅漢竹優(yōu)先聚在一起，再與小琴絲竹和鳳尾竹聚類，然后青皮竹和慈竹聚類，與未經低溫處理前的相同；類群Ⅱ由３個系組成：硬頭黃竹和實心竹聚在一起，再與粉單竹聚類，最后再與巨竹聚在一起；類群Ⅲ由斑竹與苦竹組成。

由以上分析可以得出，小琴絲竹和鳳尾竹、釣魚竹和羅漢竹、青皮竹和慈竹、硬頭黃竹和實心竹在低溫處理后分子水平上的變化比較相似，遺傳距離更近，這也直接影響其生理生化性質的變化。

３小結

低溫處理后，有的竹種ｃＤＮＡ的ＲＡＰＤ譜帶出現(xiàn)原有譜帶的消失和新譜帶的出現(xiàn)以及原有譜帶強度的增強和減弱，有的竹種ＲＡＰＤ譜帶未發(fā)生改變。不同竹種ｃＤＮＡ的ＲＡＰＤ譜帶的變化與其抵御低溫脅迫密切相關，而且譜帶的變化因竹種而異。聚類分析結果表明，遺傳距離較近的竹種，低溫處理后，ｃＤＮＡ的ＲＡＰＤ譜帶的變化比較一致。

參考文獻：

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