嗜熱真菌木聚糖酶1YＮA的表達和定點突變

摘要：為了進一步提高嗜熱真菌（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ１０６３５）本已較耐熱的木聚糖酶１ＹＮＡ的熱穩定性。利用重疊延伸ＰＣＲ技術從嗜熱真菌基因組ＤＮＡ中擴增獲得了木聚糖酶１ＹＮＡ的基因ｘｙｌ，將其插入到大腸桿菌表達載體ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中，構建了重組表達質粒ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ。該質粒轉化到表達宿主大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后獲得了能成功表達的工程菌。工程菌表達木聚糖酶１ＹＮＡ的最適溫度為６５℃，最適ｐＨ值為６．０。其在７５℃，ｐＨ值為６．５的條件下失活處理３０ ｍｉｎ后還殘存有３０％的酶活，與嗜熱真菌生產的木聚糖酶特性相近。在對該木聚糖酶的Ｎ端氨基酸序列進行定點突變后發現，Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ均對該木聚糖酶的熱穩定性無顯著影響，其中Ｔ４Ｇ突變體的耐熱性有變弱的趨勢。

關鍵詞：嗜熱真菌；重疊延伸ＰＣＲ；定點突變；木聚糖酶

中圖分類號：Ｑ９３９．５；Ｑ７８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1488-06

Characterization and Site-directed Mutagenesis of Xylanase 1YNA from

Thermomyces lanuginosus DSM10635

ＦＵ Ｚｈｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｈｕａ－ｓｈａｎ２，ＺＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｙｉｎｇ１，ＸＩＯＮＧ Ｈａｉ－ｒｏｎｇ１

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ－ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００７３，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００６８，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｘｙｌａｎａｓｅ １ＹＮＡ ｇｅｎｅ ｘｙｌ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ１０６３５． Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ－２２ｂ（＋） ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ｖｅｃｔｏｒ

ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ； ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈｏｓｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌａｎａｓｅ １ＹＮＡ ｗａｓ ６５℃， ｐＨ ６．０． Ｔｈｅ ｘｙｌａｎａｓｅ ｒｅｍａｉｎｅｄ ３０％ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ３０ｍｉｎ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐＨ ６．５， ７５℃． Ａ ｆｅｗ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｘｙｌａｎａｓｅ １ＹＮＡ ｗｅｒｅ ｃｈａｎｇｅｄ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｘｙｌａｎａｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ Ｔ４Ａ ａｎｄ Ｔ４Ｒ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｐａｒｅｎｔ， ｗｈｉｌｅ Ｔ４Ｇ ｓｈｏｗｅｄ ｗｅａｋｅｒ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ； ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ； ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ； ｘｙｌａｎａｓｅ

木聚糖酶（Ｘｙｌａｎａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．８）是可將木聚糖降解成低聚木糖和少量木糖的一類酶的總稱。狹義上的木聚糖酶限指內切β－１，４－木聚糖酶，是木聚糖降解過程中最關鍵的一個酶［１－３］。木聚糖酶在現代工業中的重要性越來越明顯。目前該酶主要應用于制漿造紙、飼料和食品等行業。木聚糖酶用于制漿造紙行業的預處理可提高紙漿的白度和減少化學漂白劑的使用；用于飼料行業能增加飼料的利用率和減少動物胃腸道疾病的發生；用于食品行業主要是對小麥面粉的改良和在釀酒方面的應用等。木聚糖酶是利用非淀粉質原料生產酒精過程中的一個關鍵酶。隨著生物質能源事業發展，木聚糖酶必將得到更廣泛的應用。

自１９８３年Ｂｅｒｎｉｅｒ等首次從Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中分離得到木聚糖酶基因以來，許多來自細菌、放線菌、霉菌、酵母菌和藻類等不同生物的木聚糖酶基因被克隆表達和分析。嗜熱真菌Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ產生的木聚糖酶由于其高耐熱性越來越受到關注［４］。嗜熱真菌Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ１０６３５是從捷克的土壤中分離得到的一株耐熱型菌株，它產生的木聚糖酶是一種耐高溫酶，在較高溫度（５０～８０℃）條件下穩定。Ｘｉｏｎｇ等［５］對該嗜熱真菌ＤＳＭ１０６３５所分泌的木聚糖酶進行了詳細的研究。該木聚糖酶屬于糖基水解酶第１１家族，其最適ｐＨ值為６．０，最適溫度為７０℃，并且在ｐＨ值為５．５～９．０下都具有很高的酶活性。質譜結果還表明嗜熱真菌ＤＳＭ１０６３５產生的木聚糖酶的分子量為２１ ２９５．１７ Ｄａ，與ＤＳＭ５８２６產生的木聚糖酶（１ｙｎａ）的分子量極為相近。

耐高溫酶的應用前景廣闊。在使用酶制劑的工業大生產中，高溫過程常常不可避免或對工藝有幫助，例如高溫能加快生化反應速度，提高液體物料的流動性能，防止有害微生物在過程中的生長繁殖等，目前大規模使用的酶制劑主要是通過工程菌發酵獲得的。基于ＰＣＲ技術的不斷發展和完善，運用基因工程和蛋白質工程的方法對木聚糖酶基因進行操作已經非常普遍［６－１２］。定點突變改變木聚糖酶分子的氨基酸殘基能導致酶特性的改變［１３－１７］。目前的研究多聚焦于第１１家族的中溫木聚糖酶，并且通過定點突變等方法獲得了許多較耐熱的突變體［１８－２０］。總體來說，這些中溫木聚糖酶的突變體熱穩定性并未達到滿意的程度，大多數突變體的熱穩定性僅僅與未修改的耐熱木聚糖酶的熱穩定性接近。直接利用本身已較耐熱的木聚糖酶為模板進行基因修改將極有可能獲得更耐熱的突變體。

本研究對嗜熱真菌Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ１０６３５的木聚糖酶１ＹＮＡ進行了原核表達。由于此木聚糖酶基因中只含有一個內含子，實驗中沒有采用獲得木聚糖酶基因的ＲＮＡ后逆轉錄得到ｃＤＮＡ的方法來獲得木聚糖酶的編碼基因，而是利用特異性引物進行重疊延伸ＰＣＲ獲得的木聚糖酶１ＹＮＡ編碼基因，然后將其與原核表達載體連接后轉入宿主菌能誘導表達木聚糖酶。文獻查詢沒有關于木聚糖酶１ＹＮＡ的基因表達的報道，本文是首次對該耐熱木聚糖酶進行表達和基因定點修改，為今后實驗工作的進一步開展打下了基礎和指明了方向。

１材料與方法

１．１實驗材料

嗜熱真菌Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ１０６３５購自德國微生物菌種保藏中心（ＤＳＭＺ）。克隆載體ｐＧＥＭＴ－ｅａｓｙ購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。表達載體

ｐＥＴ－２２ｂ（＋）購自Ｎｏｖａｇｅｎ公司。大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ５α來自中國農業科學院飼料研究所實驗室。實驗所用的限制性內切酶ＮｃｏⅠ、ＸｈｏⅠ，Ｔ４ ＤＮＡ連接酶，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ聚合酶，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ回收試劑盒，質粒提取試劑盒均購自ＴａＫａＲａ公司。木聚糖購自Ｓｉｇｍａ公司，其他化學試劑均為國產分析純。

１．２實驗方法

１．２．１木聚糖酶基因ｘｙｌ的克隆參考ＧｅｎＢａｎｋ中嗜熱真菌Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ５８２６（登錄號Ｕ３５４３６）的木聚糖酶基因序列及相關的Ｇ１１家族的木聚糖酶基因序列來進行序列比對分析，從而設計特異性的簡并引物ｆ１，ｆ２和ｒ（表１）對總ＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增，這些引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物ｆ１是根據木聚糖酶基因的起始位點前面一段序列設計的，而引物ｆ２是根據木聚糖酶基因中間一段相對保守序列設計的。將純化后的ＰＣＲ產物與ｐＧＥＭＴ－ｅａｓｙ連接后轉化ＤＨ５α感受態細胞，挑選陽性克隆子送去北京擎科生物技術有限公司測序。

１．２．２木聚糖酶１ＹＮＡ的原核表達對ｆ１－ｒ，ｆ２－ｒ兩種引物對的ＰＣＲ產物的測序結果進行序列比對。結果表明，此木聚糖酶基因只含有一個約１００ｂｐ的內含子。設計含有酶切位點的特異性引物對ｆ１－ｒ引物對的PCR產物進行重疊延伸ＰＣＲ，ＰＣＲ擴增條件為：９４℃、５ ｍｉｎ；９４℃、３０ ｓ，６７℃、３０ｓ，７２℃、４０ ｓ，循環３０次；７２℃、１０ ｍｉｎ；４℃保存。經過兩輪ＰＣＲ后得到含有酶切位點ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ的ＰＣＲ產物ｘｙｌ片段，此片段和經兩種內切酶切割后的ｐＥＴ－２２ｂ（＋）空質粒載體在Ｔ４ ＤＮＡ連接酶的作用下連接為重組質粒ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ，電擊轉化感受態細胞ＢＬ２１（ＤＥ３），涂布于含１００ μｇ／ｍＬ氨芐青霉素（簡稱Ａｍｐ）的ＬＢ固體平板后，挑選陽性克隆子培養，以進行木聚糖酶酶活的初步測定，顯示有酶活的克隆子送去南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

１．２．３木聚糖酶突變體Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ的原核表達通過對原核表達的木聚糖酶的氨基酸序列進行分析，可以對其Ｎ端的某個氨基酸進行定點突變獲得高穩定性的木聚糖酶突變體，設計引物將其第４位的蘇氨酸突變為丙氨酸（引物ｄＦ１）、甘氨酸（引物ｄＦ２）或精氨酸（引物ｄＦ３），改變其Ｎ－端的疏水性來提高其熱穩定性，利用定點突變引物和反向引物對提取的質粒ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ進行擴增。ＰＣＲ的條件是：９４℃、５ ｍｉｎ；９４℃、３０ ｓ，６７℃、３０ ｓ，７２℃、１ ｍｉｎ，循環３０次；７２℃、１０ ｍｉｎ；４℃保存。將純化后的ＰＣＲ定點突變產物和經限制性內切酶ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ消化后的ｐＥＴ－２２ｂ（＋）空質粒載體在Ｔ４ ＤＮＡ連接酶的作用下構建ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ突變重組質粒。４２℃熱激轉化感受態細胞ＢＬ２１（ＤＥ３），涂布于含１００ μｇ／ｍＬ Ａｍｐ的固體平板后過夜培養，挑選陽性克隆子進行５０ ｍＬ搖瓶培養并進行誘導，用３，５－二硝基水楊酸（ＤＮＳ）法初步測定其是否具有酶活，有木聚糖酶表達的克隆子送去南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

１．２．４木聚糖酶１ＹＮＡ及其突變體Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ的酶液制備將在ＬＢ（含１００ μｇ／ｍＬ的Ａｍｐ）固體平板上活化生長的單克隆子接入含有ＬＢ培養基（Ａｍｐ的濃度為１００ μｇ／ｍＬ）的１．５ ｍＬ離心管，搖床培養４ ｈ后按１％（ｍ／ｍ）的比例接入到１００ ｍＬ ＬＢ培養基中，３７℃，２００ ｒ／ｍｉｎ搖床過夜，加入終濃度為０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ溶液誘導培養４８ ｈ。培養液４℃，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ后取上清加入硫酸銨至其達到８０％的飽和度，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心０．５ ｈ后沉淀用５０ ｍｍｏｌ／Ｌ的檸檬酸－磷酸緩沖液（ｐＨ值為６．５）溶解，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ后取上清４℃保存備用。

１．２．５木聚糖酶酶特性的鑒定實驗采用ＤＮＳ法測定木聚糖酶的酶活。一個酶活力單位的定義為：在６０℃和ｐＨ值為６．５的條件下，每分鐘水解木聚糖底物產生１ μｍｏｌ木糖所需酶量為１個國際酶活力單位。酶活的測定以Ｄ－木糖作為標準。在木聚糖酶酶活測定的實驗中，ｐＨ值為４～７用的是檸檬酸－磷酸緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）；ｐＨ值為７～９用的是Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）。木聚糖酶特性的鑒定主要包括最適溫度、最適ｐＨ值和熱穩定性的測定。每個結果均為３個平行樣的平均值。①最適反應溫度的測定。０．２ ｍＬ稀釋好的酶液與１．８ ｍＬ ０．５％

（m／Ｖ，ｇ／ｍＬ，下同）木聚糖底物在不同的溫度下反應１０ ｍｉｎ，然后加入３ ｍＬ ＤＮＳ煮沸５ ｍｉｎ。最適溫度的測定分別在兩個ｐＨ值下進行。②最適反應ｐＨ值的測定。在相同的溫度下，０．２ ｍＬ稀釋好的酶液與不同ｐＨ值的１．８ ｍＬ的木聚糖底物緩沖液反應１０ ｍｉｎ，然后加入３ ｍＬ ＤＮＳ溶液煮沸５ ｍｉｎ。③熱穩定性的測定。用同一ｐＨ值的緩沖液稀釋好的酶液在不同的溫度（５０～１００℃）下失活處理３０ ｍｉｎ，然后取失活后的０．２ ｍＬ酶液與１．８ ｍＬ的０．５％木聚糖底物（ｐＨ值為６．５）在６０℃下反應１０ ｍｉｎ，再加入３ ｍＬ ＤＮＳ混勻后煮沸５ ｍｉｎ。熱穩定性的測定在３個ｐＨ值下進行。所有樣品在５４０ ｎｍ下測定其吸光度值。

２實驗結果

２．１重疊延伸ＰＣＲ的結果

選擇合適的ＰＣＲ體系對提取的總ＤＮＡ進行擴增，ｆ１－ｒ和ｆ２－ｒ兩種引物對進行ＰＣＲ后獲得比較好的結果，分析兩個產物的測序結果發現ｆ１－ｒ這對引物ＰＣＲ擴增后的產物長度比ｆ２－ｒ的產物長，即ｆ２－ｒ的ＤＮＡ序列包含在ｆ１－ｒ的ＤＮＡ序列中，與實驗預期的結果基本符合。在Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ聚合酶作用下，采用不同特異性引物組合（ｍＦ，ｍＲ，ｚＦ，ｚＲ）對ｆ１－ｒ引物ＰＣＲ的產物進行重疊延伸ＰＣＲ（圖１），結果顯示ＰＣＲ產物的ＤＮＡ長度分別約為２００ ｂｐ和４００ ｂｐ（圖２泳道２、３）。將兩種純化后的ＰＣＲ產物加入到含有Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ聚合酶和引物（ｍＦ，ｍＲ）的體系中進行ＰＣＲ擴增。獲得６００ ｂｐ左右的ＤＮＡ片段，這就是目的片段ｘｙｌ（圖２泳道４）。

２．２重組表達質粒的構建及驗證

將經過測序驗證的木聚糖酶基因ｘｙｌ以正確的開放閱讀框連接到原核表達載體ｐＥＴ－２２ｂ（＋）上，獲得重組表達質粒ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ（圖３），轉化大腸桿菌感受態細胞ＢＬ２１（ＤＥ３），挑選陽性克隆子培養，用試劑盒提取其質粒ＤＮＡ，經限制性內切酶ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切后得到與ｐＥＴ－２２ｂ（＋）（空質粒雙酶切后的片段）以及目的基因ｘｙｌ大小相符的ＤＮＡ片段（圖４），說明木聚糖酶基因ｘｙｌ已正確插入到原核表達載體ｐＥＴ－２２ｂ（＋）上。

２．３木聚糖酶１ＹＮＡ及其酶突變體Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ的酶特異性鑒定

２．３．１木聚糖酶１ＹＮＡ的酶特異性鑒定木聚糖酶１ＹＮＡ最適溫度的測定在ｐＨ值為５．０和６．５下進行，兩個ｐＨ值條件下都是在６５℃反應１０ ｍｉｎ時相對酶活達到最大值，因此確定原核表達木聚糖酶１ＹＮＡ的最適溫度為６５℃（圖５）。木聚糖酶１ＹＮＡ的最適ｐＨ值為６．０。在５０、７０℃的反應條件下，木聚糖酶在ｐＨ值為６．０時都具有相對比較大的酶活（圖６）。木聚糖酶１ＹＮＡ的失活曲線顯示其在ｐＨ值為６．５和８．０下穩定性比ｐＨ值為５．０要高些（圖７），在ｐＨ值為５．０的環境下，木聚糖酶６０℃處理３０ ｍｉｎ后只殘留約７０％的相對酶活，而經過相同的失活處理后，ｐＨ值為６．５和８．０條件下的相對殘留酶活基本沒有下降；在６５℃處理３０ ｍｉｎ后，不同ｐＨ值下的差別更明顯，在ｐＨ值為６．５和８．０條件下的相對殘留酶活還有８０％以上，而在ｐＨ值為５．０的環境下１ＹＮＡ只剩下約４０％的相對殘留酶活；木聚糖酶１ＹＮＡ在ｐＨ值為５．０，１００℃下處理３０ ｍｉｎ后基本喪失所有酶活，而相同條件處理后在ｐＨ值為６．５和８．０環境下還殘留有少部分酶活。

２．３．２木聚糖酶突變體Ｔ４Ａ，Ｔ４Ｇ，Ｔ４Ｒ的熱穩定性鑒定實驗成功完成了將木聚糖酶１ＹＮＡ的第４位蘇氨酸基因定點突變為丙氨酸（Ｔ４Ａ）、甘氨酸（Ｔ４Ｇ）或精氨酸（Ｔ４Ｒ），并對突變結果進行了表達。表達產物均有木聚糖酶活力。對木聚糖酶突變體Ｔ４Ａ，Ｔ４Ｇ，Ｔ４Ｒ進行了熱穩定性的測定（圖８～１０）。在ｐＨ值為５．０的環境下，６０℃熱處理３０ ｍｉｎ后，木聚糖酶突變體Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ的相對殘留酶活分別為７６．６１％，５１．９４％和６２．４８％。而在ｐＨ值為６．５和８．０環境下３種突變酶的相對殘留酶活基本沒有變化；３種突變酶在ｐＨ值為５．０的環境下，６５℃熱處理３０ ｍｉｎ后就基本喪失所有酶活，但在ｐＨ值為６．５和８．０環境下３種酶表現出不一樣的熱穩定性，Ｔ４Ａ的相對殘留酶活分別是７２．２１％和６６．２９％，Ｔ４Ｇ的相對殘留酶活最低，分別是６０．２８％和５５．７４％，Ｔ４Ｒ的相對殘留酶活分別是６５．２７％和６０．６１％。總的來說，３種突變酶在ｐＨ值為６．５和８．０下的熱穩定性都高于ｐＨ值為５．０下的熱穩定性。

３討論

本研究以產耐熱木聚糖酶的嗜熱真菌Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ ＤＳＭ１０６３５為實驗材料，克隆了其木聚糖酶基因ｘｙｌ并進行了原核表達。該木聚糖酶基因的編碼序列含有５８８個堿基，共編碼１９６個氨基酸。從實驗所得的結果我們可以看出，利用重疊延伸ＰＣＲ的方法獲得木聚糖酶１ＹＮＡ的蛋白質編碼序列是完全可行的，并且取得比較好的效果，這樣做比用傳統方法更容易獲得編碼序列。傳統方法獲得具有內含子的基因編碼區主要是通過提取ｍＲＮＡ再經過逆轉錄酶反應得到ｃＤＮＡ，這種方法有一定的弊端，首先提取ｍＲＮＡ的提取過程比較繁瑣，最主要原因是提取液中目的ｍＲＮＡ的含量較少而且容易被廣泛存在的ＲＮＡ酶降解。重疊延伸ＰＣＲ以前多用于兩個基因的連接（如融合蛋白）和蛋白質中間區域某個氨基酸的突變，此外還可以用于多個外顯子的拼接。陸長梅等［１３］設計重疊延伸引物，從Ｔ． ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４基因組ＤＮＡ中通過ＰＣＲ方法獲得４個外顯子，然后再通過重疊延伸ＰＣＲ方法將４個外顯子按順序一個個拼接，通過８次ＰＣＲ反應就成功獲得了與ＧｅｎＢａｎｋ上外顯子序列完全一樣的成熟ｘｙｎⅢ的ｃＤＮＡ序列。對于只含有少數內含子的基因，使用重疊延伸ＰＣＲ的方法獲得其蛋白質編碼序列更具有優越性。

由于缺少蛋白質糖基化修飾過程，原核表達的木聚糖酶在氨基酸序列沒有變化的情況下其熱穩定性一般要比嗜熱真菌產生的木聚糖酶熱穩定性低。本文的實驗結果也證實了這個現象。通過比較大腸桿菌重組表達的木聚糖酶１ＹＮＡ與嗜熱真菌ＤＳＭ１０６３５所分泌的原酶［３］發現，木聚糖酶１ＹＮＡ的最適溫度比原酶約低５℃，最適ｐＨ值差別不大，其他酶特性比較相似。

通過定點突變技術，本文對原核表達的木聚糖酶１ＹＮＡ進行了單個氨基酸修改。第１１家族木聚糖酶的Ｎ端是基因突變位點較為集中的區域。由于該區域結構較為松散，從蛋白質數據庫文件ＰＤＢ立體結構分析圖能夠觀察到第４位的蘇氨酸的羥基擾亂了Ｎ端肽鏈結構的完整性。我們嘗試改變第４位的蘇氨酸為其他不同氨基酸，探討木聚糖酶１ＹＮＡ的熱穩定性和Ｎ端結構的關聯性。木聚糖酶突變體（Ｔ４Ａ，Ｔ４Ｇ，Ｔ４Ｒ）與１ＹＮＡ比較，熱穩定性已經發生了變化但相對變化不大，其中Ｔ４Ｇ導致酶的耐熱性有變弱的趨勢。１ＹＮＡ在ｐＨ值為５．０下６０℃處理３０ ｍｉｎ后還剩余約７０％的相對殘留酶活，而Ｔ４Ａ在相同條件下處理后相對殘留酶活剩余約８０％，Ｔ４Ｒ的相對殘留酶活次之，為６０％左右，Ｔ４Ｇ的相對殘留酶活最低，只達到５０％。３種木聚糖酶突變體在ｐＨ值為６．５和８．０下的熱穩定性也低于１ＹＮＡ在ｐＨ值為６．５和８．０下的熱穩定性。

對本身已較耐熱酶蛋白質的結構進行修改以期進一步提高其熱穩定性是一個挑戰。本研究首次對耐熱木聚糖酶１ＹＮＡ進行了表達和基因修改，為今后進一步研究該耐熱木聚糖酶打下了基礎和指明了方向。

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