奉化水蜜桃多酚氧化酶提取純化工藝研究

摘要：對奉化水蜜桃多酚氧化酶（ＰＰＯ）的提取分離工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，ｐＨ值對該酶的提取率影響最大，該酶的最佳提取條件為ｐＨ值８．０，提取時間４０ ｍｉｎ，料液比１∶１２（ｍ∶Ｖ，ｇ∶ｍＬ），離子強(qiáng)度０．２ｍｏｌ／Ｌ。硫酸銨分級沉淀研究表明，該酶主要在硫酸銨飽和度為５０％～８０％時發(fā)生沉析，故可利用這段濃度范圍對該酶進(jìn)行純化，其純化倍數(shù)為１３．２１。同時，水蜜桃ＰＰＯ對兒茶素表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和性，其酶促反應(yīng)米氏常數(shù)（Ｋｍ）為０．２２ ｍｍｏｌ／Ｌ，最大反應(yīng)速度（ｖｍａｘ）為２５１．６９ Ｕ／ｍｉｎ。

關(guān)鍵詞：水蜜桃；多酚氧化酶；提取

中圖分類號：ＴＳ２６４．４文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1450-04

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｆｅｎｇｈｕａ Ｈｏｎｅｙｄｅｗ Ｐｅａｃｈ

ＬＵ Ｌｉ－ｎａ１，LU Jie１，ＬＩＵ Ｌｉａｎｇ２，ＣＡＯ Ｓｈａｏ－ｑｉａｎ１

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｗａｎｌｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｉｎｇｂｏ ３１５１００， Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ；

２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Cｏｌｌｅｇｅ， Ｎｉｎｇｂｏ ３１５１００， Ｚｈｅｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎa）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｏｒｍ ｈｏｎｅｙｄｅｗ ｐｅａｃｈ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｘｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ｐＨ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｐＨ ８．０； ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ４０ ｍｉｎ； ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １∶１２； ｉｏｎｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ０．２ ｍｏｌ／Ｌ． Ｓａｌｔｉｎｇ－ｏｕｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ５０％ ａｎｄ ８０％ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｌｄ ｗａｓ １３．２１． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ＰＰＯ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ（＋）－ｃａｔｅｃｈｉｎ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ０．２２ ｍｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ２５１．６９ Ｕ／ｍｉｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｏｎｅｙｄｅｗ ｐｅａｃｈ；ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

桃是一種營養(yǎng)價值很高的水果，原產(chǎn)于我國，栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，在果樹生產(chǎn)中占有重要地位。中國為世界產(chǎn)桃大國，而浙江省是中國的桃主產(chǎn)區(qū)之一，所產(chǎn)的桃果色、香、味、質(zhì)俱佳，倍受消費者歡迎，在果品市場占據(jù)了重要地位。水蜜桃是浙江省地方名優(yōu)產(chǎn)品，果實皮薄汁多，味甜質(zhì)糯，口感細(xì)膩，具有較強(qiáng)的市場競爭力，近年來，其栽培面積及產(chǎn)量增加迅速。奉化是中國四大桃傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)之一，是被國務(wù)院命名的“中國水蜜桃之鄉(xiāng)”，現(xiàn)有水蜜桃種植面積不少于２ ６６７ ｈｍ２，奉化水蜜桃被譽(yù)為“瓊漿玉露、瑤池珍品”。

水蜜桃屬軟果類乙烯躍變型果實，其受采后生理、表面帶菌和采收季節(jié)等因素影響采后易褐變腐爛，不耐貯藏。果蔬酶促褐變主要涉及ＰＰＯ催化氧化果蔬中酚類物質(zhì)的反應(yīng)。ＰＰＯ是植物組織中廣泛存在的一類含銅酶類，在有氧存在的條件下催化氧化單酚和二元酚變成相應(yīng)的醌。Ｒｏｕｅｔ－Ｍａｙｅｒ等［１］研究發(fā)現(xiàn)，蘋果中的ＰＰＯ可以氧化兒茶素和綠原酸，并生成醌類化合物，這些醌類化合物會促進(jìn)蘋果的褐變。Ｌｏｐｅｚ－Ｓｅｒｒａｎｏ和Ｂａｒｃｅｌｏ［２］分別研究了草莓中ＰＰＯ和過氧化物酶對褐變的影響，研究表明，草莓的褐變主要由ＰＰＯ引起。水蜜桃貯藏及加工過程中同樣發(fā)生嚴(yán)重的酶促褐變，影響產(chǎn)品品質(zhì)。因此，研究水蜜桃中引起褐變的酶類對水蜜桃的工業(yè)化有非常重要的指導(dǎo)作用。

目前，對桃中的酶促氧化研究主要集中在果實貯藏或加工過程中ＰＰＯ活性變化的研究上［３－６］，對桃中ＰＰＯ特性研究也有報道［７－９］，而對水蜜桃ＰＰＯ提取的研究鮮見報道。本文從水蜜桃中提取ＰＰＯ，對其工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究了ＰＰＯ對水蜜桃中主要酚類物質(zhì)兒茶素的氧化作用，為進(jìn)一步闡明水蜜桃褐變機(jī)制以及水蜜桃貯藏或加工中護(hù)色保鮮技術(shù)提供了一定的理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料試驗用水蜜桃為奉化玉露，選擇達(dá)到商業(yè)成熟度、新鮮、色澤好且無機(jī)械損傷的蜜桃榨汁取果肉，密封置于－１８℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

１．１．２試劑試驗所用試劑丙酮、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無水硫酸銨、ＰＶＰＰ等均為分析純；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品購于Ｓｉｇｍａ公司。

１．１．３主要儀器設(shè)備ＵＶ－１７００紫外可見分光光度計（日本島津公司），磁力攪拌器，高速組織搗碎機(jī)，冷凍離心機(jī)。

１．２方法

１．２．１ＰＰＯ丙酮干粉的制備１００ ｇ原料中加入冷凍丙酮（－２０℃）２００ ｍＬ，用高速組織搗碎機(jī)勻漿

２ ｍｉｎ。丙酮浸泡一段時間后，用布氏漏斗抽濾，濾餅用１００ ｍＬ冷凍丙酮再次提取后抽濾，將二次提取后濾餅置于蒸發(fā)皿中，室溫下通風(fēng)干燥，得到ＰＰＯ丙酮干粉。

１．２．２ＰＰＯ活性的測定采用分光光度法，以兒茶素為底物測定ＰＰＯ活性，具體方法如下。１．９８ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ值為６．８的磷酸緩沖液和１ ｍＬ

３ ｍｍｏｌ／Ｌ底物，調(diào)零后快速加入０．０２ ｍＬ酶液，開始計時，用紫外分光光度計在４２０ ｎｍ下每隔３０ ｓ讀取吸光值，計時３ ｍｉｎ，平行測定３次。依據(jù)曲線最初直線部分（反應(yīng)初速度）計算酶活力，以每分鐘吸光值增加０．００１為１個酶活性單位。酶活力計算公式為：酶活力＝△Ａ／（Ｖｓ×ｔ×０．００１），其中△Ａ／ｔ即為反應(yīng)初速度（吸光值－時間曲線的斜率），Ｖｓ為酶的取樣體積。

１．２．３蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法［１０］。

１．２．４ＰＰＯ提取單因素試驗以ＰＰＯ丙酮干粉為原料，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液為提取液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為３％的ＰＶＰＰ，置于磁力攪拌機(jī)上攪拌２０ ｍｉｎ后于４℃下靜置，然后８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清得粗酶提取液。在ＰＰＯ提取單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，從而確定提取ＰＰＯ的最佳工藝條件。①提取時間對ＰＰＯ提取的影響。稱取１０ ｇ ＰＰＯ丙酮干粉，溶于８０ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ的ｐＨ值為７．０的預(yù)冷磷酸緩沖液中，再加入０．３ ｇ ＰＶＰＰ。置于磁力攪拌機(jī)上攪拌２０ ｍｉｎ后于４℃下靜置，每隔一段時間測定一次酶活力，從加入磷酸緩沖液開始計算提取時間，確定最佳提取時間。②料液比對ＰＰＯ提取的影響。稱取５ ｇ ＰＰＯ丙酮干粉５份，分別加入０．１５ ｇ ＰＶＰＰ，以不同的料液比（１∶６，１∶８，１∶１０，１∶１２，１∶１４，

ｇ∶ｍＬ）用０．１ ｍｏｌ／Ｌ 的ｐＨ值為７．０的預(yù)冷磷酸緩沖液提取ＰＰＯ，提取時間為１ｈ。測粗酶提取液酶活力，確定ＰＰＯ提取的最佳料液比。③ｐＨ值對ＰＰＯ提取的影響。稱取５ ｇ ＰＰＯ丙酮干粉５份，分別加入０．１５ ｇ ＰＶＰＰ，以不同ｐＨ值（６．０，７．０，８．０，９．０，１０．０）的０．１ ｍｏｌ／Ｌ磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液為提取液，料液比１∶８（ｇ∶ｍＬ，下同），提取時間１ｈ。測定粗酶提取液的酶活力，確定最佳提取ｐＨ值。④離子強(qiáng)度對ＰＰＯ提取的影響。稱取５ ｇ ＰＰＯ丙酮干粉６份，分別加入０．１５ｇ ＰＶＰＰ，以０．１ ｍｏｌ／Ｌ的ｐＨ值為７．０的預(yù)冷磷酸緩沖液為提取液，分別不加或加入不同量ＮａＣｌ調(diào)節(jié)提取液離子強(qiáng)度（０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６ ｍｏｌ／Ｌ），料液比１∶８，提取時間１ ｈ。測定粗酶提取液的酶活力，確定最佳離子強(qiáng)度。

１．２．５ＰＰＯ提取的正交試驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平正交試驗。

１．２．６ＰＰＯ的硫酸銨分級沉淀將粗酶提取液放置在磁力攪拌器上，緩慢依次加入３０％、５０％、７０％、８０％、９０％飽和度的硫酸銨，每一級梯度在４℃環(huán)境下靜置２ ｈ后，４℃下８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，上清液再加入硫酸銨至下一級飽和度，靜置，離心直至９０％為止。作圖得出ＰＰＯ沉淀產(chǎn)生的硫酸銨濃度。同時，根據(jù)比酶活（酶活性／蛋白質(zhì)含量），可以計算硫酸銨沉淀法得到的ＰＰＯ的純化倍數(shù)。

１．２．７ＰＰＯ米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率測定在室溫下，測定ＰＰＯ與不同濃度的兒茶素底物的反應(yīng)初速率ｖ０（Ｕ／ｍｉｎ），根據(jù)Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ作圖法［１１］用１／ｖ０對１／Ｓ作圖，求出最大反應(yīng)速率ｖｍａｘ和米氏常數(shù)Ｋｍ。

２結(jié)果與討論

２．１ＰＰＯ的提取

由圖１可知，水蜜桃ＰＰＯ提取效果隨時間延長而增加，６０ ｍｉｎ后趨于平緩，可能６０ ｍｉｎ的提取已經(jīng)可以將原料中大部分的酶溶出。圖２表明酶提取的最佳料液比為１∶８，在此比例上增大提取液所占比例，酶的提取效率反而有所下降。水蜜桃ＰＰＯ提取的最適ｐＨ值為中性偏堿，約在ｐＨ值為８．０時提取效果最好（圖３），這說明該酶為一堿性蛋白，在弱堿性條件下有較大的溶解度，故提取效率較高。而ｐＨ值大于８．０時，提取液酶活力大幅度下降，這可能是堿性條件下使酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致酶活力顯著降低；而當(dāng)提取液為酸性時尤其是在ｐＨ值小于３的環(huán)境中，酶的結(jié)構(gòu)遭到破壞，使酶失活。由圖４可以看出，當(dāng)酶提取液離子強(qiáng)度為０．１～０．３ ｍｏｌ／Ｌ時，該酶的提取效果沒有顯著差異，但當(dāng)離子強(qiáng)度繼續(xù)增大時，酶提取效果明顯下降。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計Ｌ９（３４）正交試驗（表１）。根據(jù)正交試驗的結(jié)果（表２）可知，影響酶提取效果的因素依次為，ｐＨ值＞離子強(qiáng)度＞料液比＞提取時間，ｐＨ值影響最大；水蜜桃中ＰＰＯ提取的最佳條件為Ａ３Ｂ１Ｃ２Ｄ３，即料液比為１∶１２，提取時間為４０ ｍｉｎ，離子強(qiáng)度為０．２ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值為８．０。在此條件下提取水蜜桃ＰＰＯ，提取液總酶活力為５ ６８４．０Ｕ。

２．２ＰＰＯ的硫酸銨分級沉淀

由圖５可知，ＰＰＯ在硫酸銨飽和度達(dá)到５０％時開始沉淀，硫酸銨飽和度達(dá)到７０％時ＰＰＯ沉淀最多，達(dá)到９０％時僅有少量的酶沉淀下來。通過收集硫酸銨飽和度在５０％～８０％時的沉淀，可以得到部分純化的酶，通過這種方法得到的ＰＰＯ的純化倍數(shù)為１３．２１。

２．３ＰＰＯ米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率測定

由圖６中直線的斜率及縱軸的截距可求得水蜜桃ＰＰＯ米氏常數(shù)Ｋｍ為０．２２ ｍｍｏｌ／Ｌ，最大反應(yīng)速率ｖｍａｘ為２５１．６９ Ｕ／ｍｉｎ。Ｋｍ是酶催化反應(yīng)的一個重要特征常數(shù)，Ｋｍ值越小說明底物與酶結(jié)合的親和力越強(qiáng)。兒茶素與水蜜桃ＰＰＯ結(jié)合的親和力很強(qiáng)，酶促進(jìn)兒茶素氧化的反應(yīng)很快。而兒茶素是水蜜桃中主要多酚類物質(zhì)［１２，１３］，因此ＰＰＯ氧化兒茶素很可能是水蜜桃褐變的主要原因，在水蜜桃貯藏及加工中必須采取有效措施控制兒茶素的氧化。

３結(jié)論

本研究表明，從水蜜桃中提取ＰＰＯ的最佳條件為料液比１∶１２，提取時間４０ ｍｉｎ，離子強(qiáng)度

０．２ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值８．０。經(jīng)５０％～８０％硫酸銨分級沉淀，該酶純化倍數(shù)可達(dá)１３．２１。以兒茶素為底物，該酶的米氏常數(shù)Ｋｍ為０．２２ ｍｍｏｌ／Ｌ，最大反應(yīng)速率ｖｍａｘ為２５１．６９ Ｕ／ｍｉｎ，該結(jié)果表明，水蜜桃中主要酚類物質(zhì)兒茶素與水蜜桃ＰＰＯ親和力很強(qiáng)，這可能是水蜜桃易褐變的一個主要原因。在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步對水蜜桃的酶促褐變機(jī)制進(jìn)行研究，以探尋適當(dāng)?shù)姆篮肿兇胧瑸樗厶耶a(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供必要的技術(shù)支撐。

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