微波協同黑曲霉水解稻谷殼糖化工藝的優化

摘要：以稻谷殼為原料，采用微波預處理協同黑曲霉水解稻谷殼制備還原糖。探討了經過微波預處理后原料的粒度、酶液用量、水解溫度和水解時間對還原糖得率的影響，并采用響應面法建立二次回歸模型對水解工藝進行了優化，在水解溫度為６１℃、水解時間為１８．８ｈ、酶液用量為３１Ｕ／ｇ時，還原糖的平均得率可達到４６．１７％，比在相同工藝條件下未經微波處理的得率提高了９６．２２％。

關鍵詞：還原糖得率；稻谷殼；黑曲霉；微波預處理；響應面分析

中圖分類號：ＴＳ２０１．３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1458-04

Optimization of Microwave Assisted Aspergillus niger Hydrolysis Saccharification Technics of Rice Husk

ＬＩ Ｘｉａｎｇ－ｓｕ

（Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ，Ｈｅｎｇｙａｎｇ ４２１００２，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ｗａｓ ｍａｄｅ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｈｕｌｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｓｉｚｅ， ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｔｉｍｅ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｕｎｄｅｒ ａ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ６１°Ｃ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ３１ Ｕ／ｇ， ｒｅａｃｔ ｆｏｒ １８．８ ｈ， ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ４６．１７％． Ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ｙｉｅｌｄ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ９６．２２％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗｈｉｃｈ ｈａｄｎ＇ｔ ｂｅｅｎ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒｓ ｙｉｅｌｄ； ｒｉｃｅ ｈｕｌｌ； Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ； ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ； ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ

還原糖因具有良好的生物相容性而廣泛應用于醫療、食品、化工等眾多領域。稻谷殼是豐富而廉價的農業廢棄物，大部分以焚燒的形式被處理掉，這不僅浪費了大量的資源還污染了環境。稻谷殼中含大量的纖維素、半纖維素和木質素，經降解后可得到還原糖而應用于多個領域［１］。

采用生物質降解制備還原糖方面，目前主要集中在酸水解和酶水解兩種途徑［２］。酶水解條件溫和、能耗低、無污染；酸水解污染嚴重、副產物多，對設備腐蝕性大。其中酶解作用能夠導致結晶纖維素（Ｃｘ）被內切－β－葡聚糖酶作用生成無定形纖維素和可溶性低聚糖，然后被外切－β－葡聚糖酶作用直接生成葡萄糖（Ｃ１），也可被β－葡萄苷酶水解生成纖維二糖（Ｃｓ），再被水解得到葡萄糖［３，４］。微波技術是２０世紀８０年代后期興起的一種有機合成技術，微波預處理能改變植物纖維原料的超分子結構，使纖維結晶區尺寸發生變化，提高其反應活性［５］，從而提高酶解得率。

近年來，生物質降解和微波技術由于符合“綠色、環保”的要求而發展迅速。但目前還沒有關于利用微波預處理協同黑曲霉水解稻谷殼制備還原糖的報道。本研究采用微波預處理協同黑曲霉對稻谷殼進行降解制備還原糖，對微波處理后原料的粒度、酶液用量、水解溫度和水解時間等因素對還原糖得率的影響進行了探討，并采用響應面法（ＲＳＭ）建立回歸方程，對制備工藝進行了優化。

１材料與方法

１．１材料

稻谷殼，采自湖南農村，鋸解風干后粉碎，過篩備用；黑曲霉，購于諾維信（中國）生物技術有限公司。

試驗設備主要有：三口燒瓶；ＳＨＺ－８２數顯水浴恒溫振蕩器（金壇市科興儀器廠）；ＭＡＳ－Ⅱ型常壓微波合成／萃取反應工作站（上海新儀微波化學科技有限公司）。

１．２方法

１．２．１微波預處理在帶回流裝置的三口燒瓶中加入１０．０ ｇ稻谷殼，用去離子水調節至液固比

為２０∶１（ｍ ∶ ｍ），置于ＭＡＳ－Ⅱ型常壓微波合成／萃取反應工作站中。根據劉龍飛等［６］的研究結果，將微波功率選為５６０Ｗ，升溫至沸騰并保溫，微波處理４０ ｍｉｎ。將經過微波處理后的試樣冷卻至室溫。

１．２．２還原糖的制備在經過微波處理后的試樣中加入一定量的酶液和０．２ ｍｏｌ／Ｌ的乙酸－乙酸鈉緩沖液（ｐＨ值為４．８），置于ＳＨＺ－８２數顯水浴恒溫振蕩器，將溫度升到指定溫度進行降解反應，保溫一段時間，冷卻出料，離心，離心液經適當稀釋后進行還原糖測定。將未經過微波處理的稻谷殼粉在同樣的條件下進行對比試驗。

１．２．３還原糖的檢測參照１９５９年Ｍｉｌｌｅｒ報道的還原糖測定方法。檢測方法如下，１．１ ｍＬ一定稀釋度的酶解液，加入３．０ ｍＬ ＤＮＳ沸水浴１０ ｍｉｎ，

５５０ ｎｍ處比色，以葡萄糖為標準，測定還原糖濃度。

２結果與討論

２．１單因素試驗

在探索性試驗的基礎上考察酶解稻谷殼原料粒度、酶液用量、水解時間、水解溫度各因素對還原糖得率的影響。

２．１．１原料粒度的影響分別取粒度為６０、８０、１００和１２０目經過預處理的稻谷殼粉，在其他條件相同的情況下進行對比試驗，各粒度原料還原糖得率見表１，１００和１２０目還原糖的得率較高，分別為４７．６２％和４８．０５％，兩者相近，考慮到粉碎成本，采用１００目的比較合適。原料粒度對還原糖得率的影響主要是由于機械粉碎可以破壞木質素和半纖維素與纖維素的結合層，降低三者的結晶度，改變纖維素的結晶構造［７］，有利于糖苷鍵斷裂，從而增加還原糖的得率。同時，粒度變小會使得與酶液的接觸面增大，因此也能增加糖的得率。

２．１．２酶液用量的影響酶液用量不僅直接關系到水解速度，還涉及還原糖的得率以及生產成本等問題。在經過微波預處理的１００目的稻谷殼粉中加入一定量的去離子水和不同量的酶液，控制反應溫度為６０℃，還原糖得率見表１，當酶液用量低于

３０ Ｕ／ｇ時，隨著酶液用量的增加，還原糖得率明顯增加，當超過此值時，還原糖的得率增加緩慢。

２．１．３水解溫度的影響升高溫度能夠提高反應體系的活化能進而提高反應速度，但太高的溫度又會使酶液失活，因此適當的反應溫度十分重要。取經過處理的１００目的稻谷殼粉，加入去離子水和酶液，使總酶量達到３０Ｕ／ｇ，設定不同的水解溫度，還原糖得率見表１。由表１可知，當溫度為５０～６０℃時，隨著溫度升高，水解液中的還原糖量逐漸增加，并在６０℃時得率達到４７．１１％；當溫度高于６０℃時，隨著溫度升高，得率有降低的趨勢，因此在本試驗中選取６０℃為水解溫度。

２．１．４水解時間的影響在反應溫度為６０℃、酶液用量為３０ Ｕ／ｇ、稻谷殼粉粒度為１００目的條件下，不同水解時間內反應體系中還原糖的得率見表１，隨著水解時間的延長，還原糖的得率逐漸增加，當水解時間超過１８ ｈ后再延長反應時間，還原糖得率反而減小。這說明通過１８ ｈ的水解反應，反應趨于平衡。

２．２響應面分析

２．２．１響應面法試驗設計為了使水解工藝更加科學，在單因素試驗的基礎上，根據Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ設計原則，選擇酶液用量、水解溫度和水解時間３個對稻谷殼酶解影響較大的因素，以還原糖得率為響應值，設計三因素二水平試驗，進行３次平行試驗，每次１５組試驗，得率取平均值，接下來進行響應面分析，如表２和表３所示。

２．２．２二次多元回歸模型分析根據試驗結果，運用Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ ７．１．６軟件進行二次多元回歸分析，得到二次多元回歸方程為Ｙ＝４７．６６＋２．０３Ａ＋２．１６Ｂ＋０．６８Ｃ＋０．１４ＡＢ＋０．４９ＡＣ－０．５５ＢＣ－５．１２Ａ２－３．２０Ｂ２－２．３０Ｃ２。方差分析結果見表４，模型的Ｐ為０．００４ ５，表現為極顯著，而失擬項表現為不顯著，復相關系數Ｒ２為０．９６２ ９，接近１，這表明模型與實際情況基本吻合。且Ａ２、Ｂ２和Ｃ２的系數均為負值，表明有最優值。

從表３中看出，水解溫度、水解時間和酶液用量等三因素的交互作用不顯著，不能簡單地通過調整交互作用提高還原糖得率，需要找到它們的最佳作用點，最大化地得到還原糖得率。圖１中顯示，隨著水解溫度和時間的增加，還原糖的得率隨之增加，但在６０℃附近開始出現下降的趨勢。這是因為在６０℃以前，升高水解溫度和延長水解時間可以提高反應體系的活性，并對一些副反應有抑制作用，但當溫度較高時反應體系中的還原糖會開始分解，而較長的反應時間也會加快還原糖與副產物之間的反應［８］，因此，在本試驗條件下可選取５５～６５℃為適宜的水解溫度范圍。

圖２中顯示了在一定溫度條件下，增加酶液用量將使還原糖得率增加；而當酶液用量一定時，過高的溫度又會導致還原糖的得率降低。這可以解釋為在較低溫度下，反應體系的活性較低，因此還原糖的得率相對較低，但酶液在較高的溫度下又會失去活性，同樣會導致還原糖的得率降低。

從圖３可知，隨著水解時間的延長和酶液用量的增加，還原糖的得率不斷提高，在酶液用量為

３０ Ｕ／ｇ左右時達到峰值，繼續增加酶液用量，還原糖的得率增加的趨勢減緩。這是因為稻谷殼中大分子間的β－１，４－糖苷鍵在酶液的作用下被打破，當酶液濃度偏低時，體系的活性也相應較低，隨著酶液用量的增加，體系活性增加而有利于反應加速進行，因此還原糖的得率增加，但隨著反應時間的延長，還原糖自身的分解和副反應產生的縮合反應速度也隨著增加。同時，增加酶液用量實際上是增加了酶液與稻谷殼粉的接觸面積，從而提高了還原糖的得率［９］。但當酶液與稻谷殼粉的接觸面積達到一定量后，多余的酶液無法參與反應，因此還原糖的得率增加緩慢。

通過對回歸方程求解得最優工藝條件為，水解溫度為６１℃、水解時間為１８．８ ｈ，酶液用量為

３１ Ｕ／ｇ，還原糖的得率為４８．２１％。在此工藝條件下，進行驗證性試驗，３次試驗得到的還原糖的平均得率為４６．１７％，與理論計算值非常接近，而在相同工藝條件下，未經過微波處理的還原糖得率卻只有２３．５３％。這可以認為是微波的輻射，減弱了化學鍵，使纖維結晶區尺寸發生變化，使反應活性得到了提高，有利于高分子化合物的降解，因而還原糖得率隨之提高。

３結論

在采用黑曲霉水解稻谷殼制備還原糖的過程中，原料粒度、水解溫度、水解時間和酶液用量對還原糖的得率有較大的影響，在微波的協同作用下，能夠大幅度提高還原糖的得率。較為優化的工藝條件為：粒度為１００目的稻谷殼粉，通過微波處理

４０ ｍｉｎ后，當水解溫度為６１℃、酶液用量為３１ Ｕ／ｇ、水解時間為１８．８ ｈ時，還原糖的平均得率為４６．１７％。比在相同的工藝條件下、未經微波處理的還原糖的得率提高了９６．２２％。

參考文獻：

［１］ 余興蓮，王麗， 徐偉民． 纖維素酶降解纖維素機理的研究進展［Ｊ］． 寧波大學學報（理工版），２００７，２０（１）：７８－８１．

［２］ 李德瑩，龔大春． 酶法水解木質纖維素預處理工藝進展［Ｊ］． 農產品加工·學刊，２００８（２）：５５－５８．

［３］ ＳＣＨＡＧＥＲＬ?魻Ｆ Ｈ，ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ Ｓ，ＭＯＭＣＩＬＯＶＩＣ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｕｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００６，７（１）：８０－８５．

［４］ 蘇東海，孫君社． 提高纖維素酶水解效率和降低水解成本［Ｊ］． 化學進展，２００７，１９（７）：１１４７－１１４９．

［５］ ＫＡＰＰＥ Ｃ Ｏ，ＳＴＡＤＬＥＲ Ａ． Ｍｉｃｒｏｗａｖｅｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｍ］． Ｗｅｉｎｈｅｉｍ： ＷＩＬＥＹ－ＶＣＨＶｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧａＡ，２００５．

［６］ 劉龍飛，宗水珍，邱竹． 微波促纖維素水解制備可發酵還原糖的研究［Ｊ］． 常熟理工學院學報（自然科學），２００８，２２（４）：

７７－８１．

［７］ 趙士舉，李鑫，徐翠蓮，等． 微波法從麥秸稈中提取木質素研究［Ｊ］． 科學導報，２００８，２６（１８）：６６－６８．

［８］ 劉斌，蔡敬民，吳克． 纖維素酶對稻草秸稈水解的研究［Ｊ］． 中國飼料，２００７（５）：３３－３４．

［９］ 周建，羅學剛，蘇林．纖維素酶法水解的研究現狀及展望［Ｊ］． 化工科技，２００６，１４（２）：５１－５６．