康氏木霉與酵母混合發酵處理稻草秸稈的研究

摘要：利用康氏木霉與酵母混合發酵處理稻草秸稈，結果表明酵母菌和康氏木霉之間不僅無頡頏，且酵母菌能促進康氏木霉的生長；單因素試驗確定混合發酵最適發酵時間為３ｄ，最適發酵溫度為３０℃，最適ｐＨ值為４．５；正交試驗得出酵母最佳添加量為７０％，酵母在第三天加入，尿素添加量為１％。發酵料蛋白含量可達１１．２１％，還原糖含量達到２５．４２％。

關鍵詞：康氏木霉；混合發酵；正交試驗；秸稈

中圖分類號：Ｓ８１６．７９文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1420-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｍｉｘｅｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ kｏｎｉｎｇｉｉ ａｎｄ Ｙｅａｓｔ ｆｏｒ Ｓｔｒａｗ

ＳＨＩ Ｇｕｏ－ｃｕｉ，ＹＩＮ Ｗｅｎ－Ｘｉｎ，ＺＨＡＮＧ Ｍｉｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ， Ｙａｎｂｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｏｎｇｊｉｎｇ １３３４００，Jｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ kｏｎｉｎｇｉｉ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ｙｅａｓｔ ｔｏ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｔｒａｗ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｍ ａｎｄ ｙｅａｓｔ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ kｏｎｉｎｇｉｉ． Ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３ ｄａｙｓ， ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３０℃ ａｎｄ ｔｈｅ ｐＨ ｗａｓ ４．５． Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｄｄｅｄ ｗｉｔｈ ｙｅａｓｔ ａｎｄ １％ ｕｒｅａ ｗｅｒｅ １１．２１％ ａｎｄ ２５．４２％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ７０％ ｍａｙ ｂｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｂｅｔｔｅｒ ａｄｄｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｄａｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ kｏｎｉｎｇｉｉ； ｍｉｘｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ； ｓｔｒａｗ

目前我國秸稈飼料的研究與開發利用仍處于較低水平，秸稈微生物處理菌種單一，產品種類和數量少，產業化水平低，很難實現社會化、大規模的秸稈轉化利用。當前秸稈飼料主要用于牛、羊等反芻動物和單胃草食動物的飼養，而且以軟化和改變適口性為主，通過增加采食量來達到增加產量的目的，秸稈的營養價值改變較少［１］。

現在利用微生物發酵，一般都采用混合發酵。本文中利用康氏木霉與酵母混合菌發酵處理稻草秸稈，在混合發酵中，酶促作用生成的糖立即被發酵糖的微生物所利用，這樣就維持了降解物的濃度，消除了酶合成作用受到降解物的阻遏作用，同時，也解除了反應終產物對酶的反饋抑制。所以，混合發酵的效果相對更好。

１試驗材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１菌種康氏木霉和酵母菌均由本實驗室篩選所得。

１．１．２培養基ＰＤＡ培養基：稱取２００ ｇ馬鈴薯，洗凈、去皮，切成小塊，加水１ ０００ ｍＬ后煮沸３０ ｍｉｎ用紗布過濾，再加１０～２０ ｇ葡萄糖和１７～２０ ｇ瓊脂。固體發酵培養基：６０％稻草，４０％麩皮，０．５％（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．３％ＫＨ２ＰＯ４，０．０６％ＣａＣｌ２，０．０５％ＭｇＳＯ４，微量ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，ＣｏＣｌ２，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ。酵母菌擴大培養基：稱取２００ ｇ馬鈴薯，洗凈、去皮，切成小塊，加水１ ０００ ｍＬ后煮沸３０ ｍｉｎ用紗布過濾，再加２０ ｇ葡萄糖。

以上培養基均于１２１℃下滅菌３０ ｍｉｎ。

１．２試驗方法

１．２．１菌種擴大培養從斜面取酵母菌一環接種于酵母菌擴大培養基上，２８℃條件下，搖床２００ ｒ/ｍｉｎ培養４８ ｈ，為酵母菌一級種子。

將康氏木霉接種到ＰＤＡ培養基試管中，３０℃培養３ ｄ，向試管中滴加５ ｍＬ無菌水，振蕩制備菌懸液。將菌懸液接種到固體發酵培養基中，３０℃下培養，每天攪拌１次，每次５ ｍｉｎ。

１．２．２菌種相容性試驗將酵母菌倒于馬鈴薯培養基平板，接種康氏木霉于其上。另在一馬鈴薯培養基平板上接種康氏木霉菌種，作為對照。培養條件：２５℃，在恒溫培養箱中培養。

１．２．３共發酵培養時間的確定先接入２０％康氏木霉培養后再接入２％酵母菌培養 ，以接種酵母后共發酵還原糖降到最低不再變化時作為發酵終點，此時蛋白含量不再變化。

１．２．４發酵溫度的確定酵母菌接種后，分別置于２６、２８、３０、３２、３４、３６℃條件下培養。

１．２．５發酵ｐＨ值的確定酵母菌接種后，分別置于ｐＨ值４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０條件下培養。

１．２．６康氏木霉與酵母菌混合菌試驗設計康氏木霉與酵母菌混合菌試驗設計方案見表１。

１．３測定方法

還原糖含量測定方法采用ＤＮＳ比色法測定［２］；菌落總數測定采用活菌稀釋平板計數法測定［３］； 粗蛋白質含量測定采用凱式半微量定氮法測定。

２結果與分析

２．１菌種相容性試驗

與對照組相比，康氏木霉在酵母做成的平板上長得更好，菌絲更長，更濃密，但蔓延速度稍慢，說明酵母菌和康氏木霉之間不僅無頡頏，且酵母菌能促進康氏木霉的生長。可能是酵母菌分解利用培養基中的物質時，產生的降解糖和其他一些有利于康氏木霉生長的物質，促進了康氏木霉的生長。盡管康氏木霉長勢很好，但在整個培養基中蔓延很慢，這可能是酵母菌鋪滿整個培養皿，使得康氏木霉菌絲無處可生長造成的。

２．２共發酵培養時間對混合菌發酵的影響

微生物群體生長隨著時間的延長，呈現有規律的變化。根據其生長速率不同，而將菌體生長劃分為４個階段，在恒定期（也就是穩定期）或最高生長期，菌量最多，即還原糖含量最低。因此，隨著發酵時間增加必有一個高峰出現。此試驗的目的在于確定達到還原糖含量最低的發酵時間。從表２可見，還原糖含量隨時間的延長呈遞減形式，在第三天和第四天之間變化不大，所以共發酵時間以３ ｄ為好。

２．３發酵溫度對混合菌發酵的影響

溫度是影響有機體存活生長的重要因素之一。隨著溫度的升高，物體內的酶促反應及菌體生長速度提高，當達到一定溫度后，若進一步升高，體內代謝速度受阻和紊亂，導致酶活性降低，蛋白質失活，菌體生長及繁殖速度降低。因此，只有在一定溫度范圍內，機體代謝活動與生長繁殖才能隨溫度的上升而增加。據徐文玉［4］、徐堅平等［５］報道，酵母菌的適宜生長范圍在２７～４０℃之間，因此分別設計２６～３６℃之間的不同溫度進行發酵，對發酵物的蛋白含量進行測定，其結果見圖１。由圖１可知，隨溫度升高菌體的繁殖速度加快，蛋白含量增加，當溫度上升到一定程度，若繼續升高，蛋白含量急速降低。這可能由于溫度過高引起菌體細胞生長減緩，重者可引起細胞死亡或自溶。因此，發酵的最適溫度為３０℃。

２．４發酵ｐＨ值對混合菌發酵的影響

發酵中的ｐＨ值對微生物生命活動的影響很大，主要作用在于引起細胞膜電位的變化，從而影響微生物對營養物質的吸收。每種微生物都有其最適ｐＨ值，當低于最低或超過最高ｐＨ值時，微生物的生長受阻，甚至引起培養物的死亡。本試驗在７組不同ｐＨ值條件下發酵，測得其粗蛋白含量，結果見圖２。由圖２可知，酵母菌適宜在微酸性條件下生長，粗蛋白含量在pH值４～６之間變化明顯且最適ｐＨ值為４．５，此時粗蛋白含量可達１１．２１％。當初始ｐＨ值大于６時，粗蛋白含量逐漸降低；當培養基為中性或堿性條件時，含氮量明顯減少。

２．５混合菌發酵條件的正交優化試驗結果

木霉屬菌株能夠分解纖維素酶，將纖維素分解為酵母可利用的碳源，從而促進酵母在秸稈上的生長。表３為康氏木霉與酵母菌混合發酵后的正交優化試驗結果。由表３可見，各試驗組的還原糖含量變化不大，菌落總數和ＣＭＣ酶活差異較大。還原糖以Ａ３Ｂ３Ｃ１組合最好，較Ａ１Ｂ１Ｃ１組合高２３．１％；菌落總數以Ａ３Ｂ３Ｃ１組合最高，為１３．０×１０８CFU／ｇ，較Ａ２Ｂ１Ｃ３組合高１５０．０％；ＣＭＣ酶活以Ａ２Ｂ３Ｃ２組合最好，為３３５Ｕ／ｇ，較Ａ１Ｂ１Ｃ１組合高１５３．８％。

由表４極差分析可以看出影響還原糖量和菌落總數的主要因素都是間隔時間，其次是酵母菌添加量，最后是尿素添加量；影響ＣＭＣ酶活的主要因素是酵母菌添加量，其次是間隔時間，最后是尿素添加量。所以最佳優化組合是：酵母添加量為７０％，酵母在第三天加入，尿素添加量為１％。

３結果與討論

微生物發酵秸稈的研究已有相關報道。美國農業部下屬研究所從２００多種細菌中篩選出既可固定空氣中的氮，又能利用農作物秸稈的纖維素作為惟一碳源的菌種，可使秸稈經發酵后所含蛋白質比原來提高３～４倍［６］。張景宏等［７］使用ＨＧＳ－３３、Ｍ－１８、ＬＢＳ－２０１三菌種混合發酵，接種量２％，溫度２８℃，發酵時間７２ ｈ，發酵后，粗蛋白提高９４．５０％，可溶性糖增加４４．８５％，氨基酸總量提高１．４２倍，并大大提高了作為生物催化劑的酶類含量。

本文利用康氏木霉與酵母菌混合發酵稻草秸稈，經過試驗，得到以下結果：①酵母菌和康氏木霉之間無頡頏作用，酵母菌能促進康氏木霉的生長。②酵母菌和康氏木霉混合發酵最適時間為３ ｄ，最適溫度為３０℃，最適ｐＨ值４．５；經過正交試驗確定，酵母添加量為７０％，酵母在第三天加入，尿素添加量為１％。發酵后蛋白含量可達１１．２１％，還原糖含量達到２５．４２％。

參考文獻：

［１］ 包建中．中國的白色農業—微生物資源的產業化利用［Ｍ］．北京：中國農業出版社，１９９９．７３－７５．

［２］ 陳毓荃．生物化學試驗方法和技術［Ｍ］．北京：科學出版社，２００２．

［３］ 黃曉鈺，劉鄰渭．食品化學綜合實驗［Ｍ］． 北京：中國農業大學出版社，２００２．

［４］ 徐文玉． 木質纖維素的混合菌發酵法［Ｊ］． 微生物學通報，１９９１，

１８（２）：１０３－１０６．

［５］ 徐堅平，劉均松，孔維．利用秸稈類物質進行微生物共發酵生產單細胞蛋白［Ｊ］．微生物學通報，１９９５，２２（４）：２２２－２２５．

［６］ 戴其華，徐宣鋒．生物技術用于飼料工業的研究進展［Ｊ］．飼料工業，１９９２，１３（６）：３５－３６．

［７］ 張景宏，茌亞青，趙德英，等．作物秸稈發酵飼料的開發利用［Ｊ］．中國飼料，１９９４（６）：３２－３３．