解磷突變株E652的發酵條件研究

摘要：通過對高效解磷突變株Ｅ６５２的發酵條件進行研究，結果表明，其最適宜的碳源和氮源分別為１％蔗糖和２％（ＮＨ４）２ＳＯ４，最適培養溫度３４℃，發酵液ｐＨ值控制在７．０時最利于突變株Ｅ６５２的生長，裝液量為４０ｍＬ／２５０ｍＬ時菌株生長最快。

關鍵詞：解磷菌；突變株Ｅ６５２；發酵條件

中圖分類號：Ｑ９３５；Ｓ１５４．３４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1353-03

Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ－Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｒａｉｎ Ｅ６５２ ｉｎ

Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ-Ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ

ＬＵ Ｊｉｎ－ｚｈｅｎ１，ＲＥＮ Ｊｕｎ１，ＸＩＯＮＧ Ｈａｎ－ｇｕｏ２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｗｕｈａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｗｕｈａｎ ４３０４１５， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ－ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ， Ｅ６５２， ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ １％ ｓｕｃｒｏｓｅ； while the ｏｐｔｉｍａｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｗａｓ ２％ （ＮＨ４）２ＳＯ４． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｗｅｒｅ ３４℃ ａｎｄ ７．０ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｉｎ ２５０ ｍＬ ｃｏｎｉｃ ｂｏｔｔｌｅ ｗａｓ ４０ ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ－ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ； highly-effective ｓｔｒａｉｎ Ｅ６５２； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

磷是植物生長不可或缺的三大營養元素之一，但土壤中９５％～９９％的磷為無效磷形式，植物很難直接吸收利用。我國有７４％的耕地土壤缺磷，磷肥施入土壤中后，易與Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋等金屬離子結合形成難溶性磷酸鹽，加之黏土礦物對磷的吸附，致使磷當季利用率僅為５％～２５％［１］。資料顯示，自２０世紀５０年代我國使用磷肥以來，土壤中的難溶性磷已累計儲存高達６×１０７ｔ［２］。因此，提高磷的利用率一直是農學家關注的問題。

作為生物肥力的核心組成的微生物對土壤中磷的利用率影響很大。自前蘇聯學者蒙金娜于１９３５年從土壤中分離得到一種解磷巨大芽孢桿菌以后，各國學者也紛紛開始這方面的研究［３］。人們陸續發現，土壤中有很多微生物都具有溶磷能力，能將難溶性磷轉化為有效磷的微生物稱為解磷菌［４］，如芽孢桿菌屬（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、假單胞菌屬（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、埃希氏菌屬（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、歐文氏菌屬（Ｅｒｗｉｎｉａ）、土壤桿菌屬（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等［５］。利用解磷細菌制成的菌肥施入土壤后，不僅能提高土壤有效磷含量，而且能夠加強土壤中硝化細菌和其他有益微生物的活動、改善植物根部營養、提高作物產量［６］。因此，利用解磷細菌制成生物菌肥具有重大的開發應用價值。本試驗主要研究了高效解磷突變株Ｅ６５２的適宜發酵條件，以期為工業化生產提供理論參考依據。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１ 菌種解磷突變株Ｅ６５２由武漢生物工程學院微生物實驗室選育［７］所得。

１．１．２培養基發酵培養基：碳源（玉米粉、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖）１．０％，氮源［（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＮＯ３、ＮＨ４ＮＯ３、蛋白胨］２．０％，ＣａＣＯ３ ０．１％，ＭｎＳＯ４ ０．１％，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１％，ｐＨ值７．２。

１．２方法

１．２．１培養方法取１ ｍＬ菌懸液接種到裝有５０ ｍＬ發酵培養基的２５０ ｍＬ三角瓶中，同時做不接種對照（培養基中加入１ ｍＬ無菌水），于３５℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ條件下振蕩培養４８ ｈ。所有處理均做３次重復。

１．２．２發酵條件研究通過對碳源、氮源、溫度、裝液量及ｐＨ值的單因子試驗，研究菌株Ｅ６５２的適宜發酵條件。①碳源種類的影響：按１％的比例分別以玉米粉、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖為碳源，進行搖床發酵培養，測定菌體生長量，確定最適碳源。②氮源種類的影響：按２％的比例分別以ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４ＮＯ３、ＫＮＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ４和蛋白胨為氮源，進行搖床發酵培養，測定菌體生長量，確定最適氮源。③溫度的影響：分別在２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６℃條件下進行搖床發酵培養，測定菌體生長量，確定最適生長溫度。④ｐＨ值的影響：調節發酵液的ｐＨ值分別為４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０，進行搖床發酵培養，測定菌體生長量，確定最適生長的ｐＨ值。⑤裝液量的影響：在２５０ ｍＬ三角瓶中分別裝入３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ ｍＬ發酵培養基進行振蕩培養，以考察通氣量對菌體生長的影響。

１．２．３測定方法ｐＨ值測定采用雷磁ｐＨ計。菌量測定用平板菌落計數法。

２結果與分析

２．１碳源的影響

微生物的碳源譜雖廣，但異養微生物的最適碳源則是糖類。微生物可利用的糖類包括單糖、二糖、多糖和雜多糖，而針對具體的某種細菌來講，碳源差異極大［８］。不同碳源對菌株Ｅ６５２生長的影響見圖１。由圖１可知，不同碳源對菌株Ｅ６５２生長的影響不同。在以蔗糖為碳源時，生長最好，其菌量可達６．２５×１０８個／ｍＬ；其次是可溶性淀粉；以葡萄糖為碳源時表現最差，其菌量只有２．３０×１０８個／ｍＬ。由此確定蔗糖為最佳碳源。

２．２氮源的影響

氮源是組成蛋白質和核酸的重要元素，微生物對不同的氮源具有不同程度的利用能力，選擇適宜的氮源有利于微生物的生長繁殖［９］。不同氮源對菌株Ｅ６５２生長的影響見圖２。由圖２可知，不同氮源對菌株Ｅ６５２的生長影響較大，在以（ＮＨ４）２ＳＯ４為氮源時，生長最快，其菌量達６．３０×１０８個／ｍＬ；在以ＮＨ４Ｃｌ為氮源時，菌量為５．４０×１０８個／ｍＬ；在ＫＮＯ３上生長最慢，菌量只有１．８０×１０８個／ｍＬ。故確定（ＮＨ４）２ＳＯ４為最佳氮源。

２．３溫度的影響

溫度是影響微生物生長和代謝的一個重要因素，當溫度在微生物的最適范圍內變化時，它的生長和代謝正常且平穩；超過這個范圍，則該微生物生長代謝急劇下降，甚至停止生長。不同溫度對菌株Ｅ６５２生長的影響如圖３所示。由圖３可知，菌株Ｅ６５２在３４℃時生長最快，當溫度超過３５℃后，其生長速度呈明顯的下降趨勢。因此，選取３４℃為其最佳培養溫度。

２．４ｐＨ值的影響

ｐＨ值是菌種生長的化學因子，對微生物生長的影響較大。ｐＨ值可以引起細胞膜電荷變化，影響營養物離子化程度，從而影響微生物對營養物的吸收［１０］。另外，生物體內的所有代謝過程都受酶的控制，酶的催化反應又依賴ｐＨ值，這也說明環境ｐＨ值對生物體生長有顯著影響。ｐＨ值對菌株Ｅ６５２生長影響見圖４。由圖４可知，ｐＨ值對菌株Ｅ６５２生長的影響較顯著，菌株Ｅ６５２在ｐＨ值為４．０～９．０范圍內均能生長；ｐＨ值為７．０時，最適菌株Ｅ６５２生長，菌量最高，達７．４８×１０８個／ｍＬ；而ｐＨ值為１０．０時，菌株幾乎不生長。

２．５裝液量的影響

不同裝液量對菌株Ｅ６５２的生長影響見圖５。從圖５可知，裝液量為４０ ｍＬ時，菌株Ｅ６５２的菌量達到最大。裝液量高于４０ ｍＬ后，隨裝液量的增加，菌量呈減少態勢；這說明菌株Ｅ６５２是好氧菌且需氧量較大，因而在一定程度上增大通氣量有利于其生長。

３結論

通過對菌株Ｅ６５２的發酵條件研究，確定了其最佳的碳源、氮源分別為蔗糖和（ＮＨ４）２ＳＯ４，適宜的發酵溫度為３４℃，發酵液ｐＨ值為７．０時較利于菌株生長。另外，在進行搖瓶發酵時，裝液量控制在４０ ｍＬ（２５０ ｍＬ三角瓶）時，菌株Ｅ６５２生長最快，說明其是好氧菌且需氧量較大，因而在一定程度上增大通氣量有利于其生長。

參考文獻：

［１］ 趙小蓉，林啟美．微生物解磷的研究進展［Ｊ］．土壤肥料，２００１（３）：７－１１．

［２］ 張寶貴，李貴桐． 土壤生物在土壤磷有效化中的作用［Ｊ］． 土壤學報，１９９８，３５（１）：１０２－１１１．

［３］ 李華，王光龍，谷守玉，等． 磷細菌突變株生理特性的研究［Ｊ］． 高校化學工程學報，１９９９，１３（３）：２４０－２４４．

［４］ 趙珂，陳強，陳曉琴，等． 高效無機解磷細菌ＹＭ３－２Ｓ的分離和鑒定［Ｊ］． 四川農業大學學報，２００７，２５（３）：２５７－２６１．

［５］ 唐勇， 陸玲， 楊啟銀，等． 解磷微生物及其應用的研究進展［Ｊ］． 天津農業科學， ２００１，７（２）：１－５．

［６］ 李福后，王偉霞，潘建梅． 有機磷分解細菌的選育及其發酵條件的研究［Ｊ］． 中國土壤與肥料， ２００７（６）：７４－７７．

［７］ 盧金珍，許寧，熊漢國． 高效解磷突變株的選育［Ｊ］． 湖北農業科學， ２０１０，４９（２）：３２７－３２９．

［８］ 周德慶． 微生物學教程［Ｍ］． 第二版． 北京：高等教育出版社， ２００２．８４.

［９］ 張愛華，楊啟銀，陳育如，等． 解磷細菌突變株ＰＳ－０１Ｐ菌株的選育及發酵條件的研究［Ｊ］． 安徽農業大學學報，２００４，３１（３）：３０９－３１４．

［１０］ 王成華，孫納新，王健鵬，等． 里氏木霉９１－３纖維素酶產生條件的研究［Ｊ］． 食品與發酵工業，１９９６（５）：１－６．