靜脈灌注LPS對家兔的發熱效應及肝蛋白的SDS-PAGE比較分析

摘要：以靜脈注射內毒素（ＬＰＳ）的方法建立了家兔發熱模型，并以白虎湯的降溫治療作為反證，再運用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝膠電泳比較和分析了ＬＰＳ引起的發熱效應對家兔肝臟總蛋白表達變化的影響以及肝組織病理變化。結果表明，以１５ μｇ／ｋｇ體重的ＬＰＳ靜脈注射家兔能很好地復制出動物溫病模型，模型組、治療組和對照組３組動物的肝蛋白表達均有各自的特異條帶。所以，肝組織蛋白的表達變化可以作為動物溫病研究與評價的生物學指標。

關鍵詞：ＬＰＳ；發熱模型；白虎湯；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；蛋白差異表達

中圖分類號：Ｓ８５３．１；Ｓ８５３．２１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1416-04

Ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＬＰＳ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｖｅｉｎｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ

ＺＨＡＮＧ Ｓｈｉ－ｄｏｎｇ１，ＬＩ Ｓｈｉ－ｈｏｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｄｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，ＧＯＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｚｈｅｎ２，ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，

ＬＩ Ｊｉｎ－ｙｕ１，ＬＩ Ｘｉａ１，ＹＡＮ Ｚｕｏ－ｔｉｎｇ１

（１． Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅs ／ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＣＡＡＳ／Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＬＰＳ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｖｅｉｎｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｉｚｅｄ ａｎｄ Ｂａｉｈｕ Ｓｏｕｐ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｆｅｖｅｒ ａｓ ｃｏｕｎｔｅｒｅｖｉｄｅｎｃｅ． Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＬＰＳ ｆｅｖｅｒ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｅｖｅｒ ｍｏｄｅｌ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ ｂｙ １５μｇ／ｋｇ ＬＰＳ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｖｅｉｎｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ， ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ， ＬＰＳ－ｉｎｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｂａｉｈｕ Ｓｏｕｐ ｔｒｅａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｆｅｖｅｒ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＬＰＳ； ｆｅｖｅｒ ｍｏｄｅｌ； Ｂａｉｈｕ Ｓｏｕｐ； ＳＤＳ－ＰＡＧＥ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

溫病為外感熱病。現代醫學中的傳染性與感染性疾病多屬溫病范疇，其臨床多以發熱為主癥［１］。溫病動物模型的建立及試驗研究對于揭示急性外感熱病的本質以及提高其治療手段都有重要的意義，而白虎湯作為清熱生津、溫病治療的經典方，對高熱癥的實用價值被普遍公認［２，３］。本研究建立了家兔溫病模型，并以白虎湯作降溫治療，用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝膠電泳比較分析了家兔肝臟組織蛋白的表達變化，為溫病研究提供了一定的理論依據。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１主要試劑丙烯酰胺（Ａｃｒ）、Ｎ，Ｎ’－甲叉雙丙烯酰胺（Ｂｉｓ）、過硫酸銨（ＡＰ）、四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、β－巰基乙醇、甘氨酸、溴酚藍、考馬斯亮藍Ｒ２５０等購自Ｓｉｇｍａ公司；其余試劑均為國產分析純。標準蛋白購自天根生化科技（北京）有限公司；脂多糖（ＬＰＳ，Ｏ５５：Ｂ５）購自北京拜爾迪生物技術有限公司。白虎湯由石膏、知母、粳米、甘草組成，普通煎煮，并制成１ ｇ／ｍＬ的口服液。

１．１．２試驗動物新西蘭兔１８只，普通級，雌雄不限，單籠飼養，平均體重２．０ ｋｇ，體重變異不超過平均體重的２０％，試驗動物及飼料由中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心提供。試驗前適應性飼養并測溫３ ｄ，以適應試驗環境與測溫操作。

１．１．３儀器高速冷凍離心機，ＤＹＹ－６Ｃ型電泳儀（北京六一儀器廠），ＦＤ－１Ｂ－５０型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司），垂直電泳槽，脫色搖床，酸度計，分析天平等。

１．２溫病模型的建立

將１８只兔隨機分為３組，每組６只。其中Ａ組為對照，注射生理鹽水；Ｂ組以１５ μｇ／ｋｇ ＬＰＳ靜脈灌注（模型組）；Ｃ組為１５ μｇ／ｋｇ ＬＰＳ靜脈灌注，同時灌服白虎湯治療（７ ｍＬ／ｋｇ），Ａ組、Ｂ組均灌服生理鹽水（７ ｍＬ／ｋｇ）。觀察各組動物體征變化，并每０．５ ｈ記錄肛溫１次。于試驗前連續測肛溫３次，取平均值為基礎體溫。注射ＬＰＳ ２．５ ｈ后，以空氣栓塞法處死模型組動物，６ ｈ后治療組再次灌服白虎湯（７ ｍＬ／ｋｇ），次日以空氣栓塞法處死剩下的２組動物。

１．３臟器變化及肝組織切片的制備

處死動物后，解剖并觀察皮下出血情況及心、肝、肺、脾、腎、小腸等主要臟器的病理變化。取適量肝組織，經生理鹽水漂洗后，固定于福爾馬林溶液中，經常規切片及ＨＥ染色后，觀察肝臟組織病理變化。

１．４蛋白樣品的制備

處死動物后取適量肝組織，經生理鹽水漂洗后，加入４倍體積生理鹽水和一定量的石英砂，在４℃下研磨粉碎，然后將勻漿液煮沸５ ｍｉｎ，于４℃

１１ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，取上清液在－７０℃凍存

２４ ｈ后，于－５５℃、８０Ｍｐａ下真空干燥２８ ｈ。試驗前，將干燥樣品用生理鹽水溶解為１０ μｇ／μL，電泳上樣量為３０ μＬ／ｌａｎｅ。

１．５ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據ＬａｅｍｍＬｉ的方法進行垂直電泳［４］。分離膠和濃縮膠分別為１０％和４％，電泳緩沖液為Ｔｒｉｓ－甘氨酸－ＳＤＳ（ｐＨ值為８．３）。穩流電泳，濃縮膠和分離膠電流分別為１０ｍＡ和１５ｍＡ，經過大約４ ｈ停止電泳，考馬斯亮藍Ｒ２５０常規染色，乙醇－冰乙酸脫色后制成干膠板，掃描成像，并重復電泳３次。

２結果

２．１動物癥狀與體征變化

注射ＬＰＳ后，Ｂ組動物體溫逐漸升高，精神沉郁，并出現蜷縮、發抖、聳毛、呼吸和心率加快等癥狀。至２．５ ｈ左右，發熱愈加明顯，精神較倦怠，蜷縮逐漸消失，發抖消失，皮毛濕潤，呼吸急促，心率更快，耳廓血管擴張發紅，眼結膜充血明顯，部分動物舌質偏紅，但神志清醒，拒食，少數動物有稀便。以白虎湯治療的動物（Ｃ組）體溫升高緩慢，蜷縮、發抖、聳毛、呼吸和心率加快，但與Ｂ組相比，癥狀明顯減輕。對照動物（Ａ組）表現正常，無明顯上述病癥。

２．２體溫凈增值變化

注射ＬＰＳ和經白虎湯治療后，處理組動物的體溫都明顯升高，與注射生理鹽水的空白對照組比較有顯著的差異（P＜0.05），且在２ ｈ以后，白虎湯治療組動物的體溫出現明顯的回落（圖１）。

２．３臟器及肝組織病理切片觀察

與對照組動物（Ａ組）比較，靜脈注射ＬＰＳ的動物皮下有出血點；心臟淤血；肝臟顏色發黑，部分動物肝臟表面有散在粟粒狀小膿腫；脾臟腫脹，充血，有淤血斑；肺臟有淤血，多數可見大小不等、多少不一的點片狀出血；腎臟腫脹有淤血斑，髓質部有出血；胃黏膜嚴重脫落，黏膜下層出血；小腸內積有黃色黏液。經白虎湯治療的動物肝臟顏色加深發黑、脾臟輕微腫脹、肺臟和腎臟等無明顯充血。

經肝臟病理檢查（圖２），對照組（Ａ組）動物肝臟結構正常，肝小葉清晰，肝細胞索排列整齊，肝細胞結構清晰，細胞核明顯，肝小葉間間質清晰，個別樣品有輕度淤血。模型組（Ｂ組）動物肝臟結構紊亂，肝小葉結構不清，肝細胞索排列紊亂，肝細胞廣泛水泡變性，嚴重時，肝細胞壞死、崩解，小葉間間質淤血，膽管周圍有炎癥細胞浸潤，匯管區內見較多淋巴細胞浸潤，且小膽管增生。白虎湯治療組（Ｃ組）與對照組（Ａ組）比較各組織器官仍有程度不等的損傷性變化，但與模型組（Ｂ組）比較變化轉輕，肝小葉結構輕度損傷，肝細胞索排列較清晰，肝細胞輕度顆粒變性，小葉間間質淤血。

２．４低分子量標準蛋白曲線

根據蛋白質在電泳當中其分子量的對數值與其相對遷移率呈比例關系的原理［５］，利用已知分子量蛋白質在膠板上的遷移距離，計算相對遷移率，以分子量對相對遷移率作圖，制得標準曲線，再根據未知蛋白質的相對遷移率，從標準曲線上測定其分子量。根據ＳＤＳ電泳結果，參照說明書中所給蛋白質的分子量（１９～１１７ ｋＤａ），以蛋白質分子量對數為縱坐標、相對遷移率為橫坐標繪制標準曲線（圖３）。

２．５肝臟組織的蛋白表達圖譜

各組動物的肝臟組織蛋白經ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳后結果如圖４所示。由圖４可見，條帶１為Ａ組特有；條帶２在Ｂ、Ｃ組中表達減弱；條帶３在Ａ組中表達顯著，而在Ｂ組和Ｃ組中不顯著；條帶４在Ａ組中呈強表達，而在Ｂ組和Ｃ組中表達較弱，且它們的強度相似；條帶５和６在Ａ組中都有表達，但在Ｂ組中無顯著表達，而在Ｃ組中又恢復表達，且與Ａ組相比表達有增強；條帶７在Ａ組和Ｃ組中表達量較相似，而在Ｂ組中表達較弱；條帶９在Ｂ組和Ｃ組中皆有表達，而Ａ組中無此條帶。其他條帶在３組中均無明顯的表達差異，比如條帶８在各組中都呈相似表達。進一步分析比較可發現，條帶１、３只在Ａ組中有，而ＬＰＳ作用后的Ｂ、Ｃ組中表達不顯著，說明該蛋白的表達可被ＬＰＳ作用抑制，且白虎湯治療不能使其恢復表達；條帶５、６經ＬＰＳ作用抑制表達后，白虎湯的治療則可使其恢復表達；條帶９在Ａ組中本無表達，而在Ｂ、Ｃ兩組中均有表達，說明此蛋白經ＬＰＳ作用后發生了“記憶”表達，因為在Ｃ組中白虎湯的作用并不能消除其表達。

３討論

在傳染性疾病嚴重威脅動物健康的今日，中醫溫病學研究的重要性不言而喻。溫病試驗動物模型的制作方法大體分為兩類：一類是使用病原微生物；另一類是使用其他致熱源，其中較常用者為內毒素（ＬＰＳ）。ＬＰＳ是一種重要的致熱原，微量內毒素就能引起體溫上升［６］。從試驗結果來看，靜脈注射１５ μｇ／ｋｇ的ＬＰＳ使得家兔體溫顯著升高，機體臟器發生明顯的病理變化，而白虎湯的治療也能起到顯著的降溫及治愈效果。因此，利用ＬＰＳ能很好地復制出動物溫病模型。

從ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的結果對比可以看到，３組試驗動物肝臟蛋白的表達都存在顯著差異，各組均有特異表達的蛋白，且一些分子量相似或相同的蛋白在不同處理組中表達量也有顯著差異。因為蛋白質的差異表達反映著細胞中基因的差異表達，所以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的結果表明，靜脈注射ＬＰＳ可影響家兔肝臟組織的基因表達，且白虎湯的降溫治療作用也可影響或改變ＬＰＳ造成的基因表達變化。肝臟是介于腹腔消化道與機體大循環之間一個重要的防衛器官，其在血液循環中處于關鍵位置，在機體免疫調節中也發揮著重要作用［７］。靜脈注射后， ＬＰＳ首先到達肝臟，肝臟在受到ＬＰＳ刺激時，釋放出免疫調節物質以調節肝臟本身乃至全身的免疫機能［８］。因此，蛋白的差異表達變化也可能是肝臟組織中一些免疫基因受到調控進而發生免疫因子大量表達的結果，比如圖４中蛋白條帶９的產生。

此外，研究表明ＬＰＳ可與肝組織受體ＴＬＲ４結合，激活下游信號ＮＦ－κＢ信號轉導途徑和調控絲裂原激活蛋白激酶，使機體產生系列的免疫應答，最終導致肝細胞的損傷［９］。在病理學上，肝損傷應視為肝實質細胞嚴重損害的結果，其中由多種炎癥介質相互作用參與并介導了肝細胞損傷的發生。從病理切片可以觀察到ＬＰＳ對動物肝組織產生了明顯的病理損傷（圖２）。但是，靜脈注射ＬＰＳ引起肝臟損害的機制十分復雜，對肝臟與機體的影響，遠不止內毒素的直接作用，還與內毒素激活肝臟Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞產生與釋放的細胞因子與炎癥遞質有關，這些物質直接損傷肝細胞，導致微循環障礙，組織缺氧，自由基產生增多，進一步損傷肝臟［１０］。所以，蛋白差異表達也可能是肝組織受到ＬＰＳ損傷的結果，而且白虎湯的治療作用可以緩解或改善ＬＰＳ引起的肝損傷，如圖４ Ｃ組中蛋白條帶５、６恢復了正常表達。

總之，１５ μｇ／ｋｇ劑量的ＬＰＳ能顯著引起動物的發熱效應，且對肝臟損傷及肝蛋白的表達變化有著直接影響。本研究提供的肝組織蛋白表達結果可以作為動物溫病研究與評價的生物學指標，為相關疾病的診療奠定了一定的基礎。

參考文獻：

［１］ 孫守芳．解毒白虎湯治療溫病氣分證的實驗研究［Ｄ］．福建：福建中醫學院，２００４．

［２］ 喬逸，李芳．白虎湯清熱機理探析［Ｊ］．山西中醫學院學報，２００３，４（４）：40－41．

［３］ 崔金濤． 白虎湯在高熱急癥中的運用［Ｊ］． 新疆中醫藥，２００７，

２5（６）：５２－５３．

［４］ ＬＡＥＭＭＬＩ Ｕ Ｋ． Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７：６８０－６８５．

［５］ 郭堯君．蛋白質電泳技術手冊［Ｍ］． 北京：科學出版社，２００１． １２８－１３１．

［６］ 劉健．白虎湯加減灌腸治療溫病氣分熱證的研究［Ｄ］．廣州：廣州中醫藥大學，２００６．

［７］ 張麗娟，舒曉春，肖艷輝．血清ＴＣ、ＡＬＢ、ＰＡ和ＴＢＡ測定在肝硬化中的臨床意義［Ｊ］．中國實用醫藥，２０１０，５ （１５）：１５－１６．

［８］ 劉為民，武楓林，毛鑫智．靜脈灌注ＬＰＳ對山羊血漿一氧化氮水平的影響［Ｊ］．畜牧與獸醫，２００２，３４（７）：５－７．

［９］ 涂健，王艷萍，彭開松，等．內毒素誘發雞多臟器損傷及其對肝ＴＬＲ４ｍＲＮＡ表達影響［Ｊ］．生物學雜志，２００７，２４（６）：１３－１５．

［１０］ 李英，劉宏杰，鄒萬盛，等．褪黑素對內毒素血癥山羊肝功能損傷的影響［Ｊ］．中國獸醫學報，２００９，２９（１）：８６－８８．