摘要:利用SSR引物對(duì)44份外部形態(tài)差異較大的扁穗牛鞭草基因組進(jìn)行掃描,結(jié)合農(nóng)藝性狀,進(jìn)行性狀與標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明,①扁穗牛鞭草群體的農(nóng)藝性狀存在較大變異,其中分蘗數(shù)變異最大,變異系數(shù)達(dá)34.8%,其次是單株生物量、葉長(zhǎng)和莖葉比,變異系數(shù)也達(dá)20%以上。②扁穗牛鞭草農(nóng)藝性狀間存在顯著的相關(guān)關(guān)系,單株生物量與葉寬、莖直徑、莖長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān),莖葉比與節(jié)間長(zhǎng)、莖長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān),與分蘗數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)。③通過(guò)單向分組資料的方差分析,從182條多態(tài)性條帶中共檢測(cè)到與扁穗牛鞭草8?jìng)€(gè)農(nóng)藝性狀極顯著相關(guān)的SSR標(biāo)記18?jìng)€(gè),其中,6個(gè)標(biāo)記分別與2個(gè)以上性狀關(guān)聯(lián)。標(biāo)記對(duì)性狀變異的貢獻(xiàn)率為15.1%~32.8%,SG5-160能解釋32.8%節(jié)間長(zhǎng)表型變異,引物SG25的4個(gè)標(biāo)記對(duì)莖直徑表型變異的總貢獻(xiàn)率達(dá)91.6%。該研究結(jié)果對(duì)早期發(fā)現(xiàn)優(yōu)異種質(zhì),縮小篩選范圍,降低篩選成本和工作量,加快扁穗牛鞭草育種進(jìn)程有重要意義。
關(guān)鍵詞:扁穗牛鞭草;SSR標(biāo)記;農(nóng)藝性狀;關(guān)聯(lián)分析
中圖分類號(hào):S54;Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2011)07-1494-05
Association Analysis between SSR Molecular Markers and Agronomic Characters of
Hemarthria compressa
CHEN Yong-xia1,2,ZHANG Xin-quan2,MA Xiao2,XIE Wen-gang2
(1. Department of Animal Science,Xichang College, Xichang 615000,Sichuan,China;
2. Department of Animal Science and Technology,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625000,Sichuan,China)
Abstract: 8 agronomic characters of 44 Hemarthria compressa materials were measured and 10 pairs of SSR premiers were used to amplify the genomic DNA of these materials. Single factor variance analysis was used to identify association between quantitive traits and SSR mocular markers. The result showed that: ① there were various variability among H.compressa germplasm. The variation coefficient of tillers was 34.8%. The variation coefficient of individual biomass, leaf width and stem-leaf ratio was more than 20%. ②Significant correlation was found among these agronomic characters. There were significantly positive correlation between individual biomass and leaf width, stem diameter, branch length, and significantly positive correlation between stem-leaf ratio and internode length, branch length. However, the correlation between stem-leaf ratio and tillers was significantly negative. ③The result of one-way ANOVA revealed that 18 markers out of the total 182 PCR produced bands were significantly associated with the 8 agronomic characters, among which 6 markers were associated with more than 2 traits. The contribution rate was from 15.1% to 32.8%, and the SG5-160 marker accounted for 32.8% of the phenotypic variation of internode length. The contribution rate of four markers of premier SG25 was account for 91.6% of the phenotypic variation of stem diameter. The result was useful to find excellent H. compressa germplasm early, reduce selection range, decrease screening cost and workload, and accelerate breeding process.
Key words: Hemarthria compressa; SSR marker; agronomic character; association analysis
扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa)為禾本科牛鞭草屬多年生牧草,在我國(guó)主要分布在長(zhǎng)江以南及河北、山東、陜西等地。扁穗牛鞭草生長(zhǎng)期長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高,是熱帶、亞熱帶建植人工草地和南方草山草坡改良的優(yōu)良草種。目前對(duì)扁穗牛鞭草的遺傳多樣性[1-3]、生產(chǎn)性能[4]、繁殖特性[5]等方面進(jìn)行了較為深入的研究,但對(duì)多基因控制的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)定位及與扁穗牛鞭草表型變異相關(guān)分子標(biāo)記的研究,尚未見報(bào)道。
關(guān)聯(lián)分析是一種把候選基因的遺傳變異與目標(biāo)性狀聯(lián)系起來(lái)的技術(shù),其理論依據(jù)是遺傳標(biāo)記與性狀的連鎖分析[6]。Virk等[7]對(duì)40份具代表性的東南亞水稻種質(zhì)進(jìn)行RAPD標(biāo)記與農(nóng)藝性狀間的關(guān)聯(lián)分析,檢測(cè)到與水稻的分蘗數(shù)、株高、開花期、穗長(zhǎng)、葉長(zhǎng)和粒寬相關(guān)的RAPD標(biāo)記,其中OPC-08-340可以解釋49.84%分蘗數(shù)變異。后來(lái),在燕麥[8]、大麥[9-11]、小麥[12]、馬鈴薯[13]、桑樹[14-16]、楊樹[17,18]等植物上,也找到一些與重要性狀緊密相關(guān)的標(biāo)記。但是,在牧草作物上,關(guān)聯(lián)分析僅見于紫花苜蓿[19,20]和早熟禾[21]。
扁穗牛鞭草結(jié)實(shí)率相當(dāng)?shù)停饕捎脽o(wú)性繁殖,關(guān)聯(lián)分析無(wú)需構(gòu)建專門的作圖群體,為扁穗牛鞭草的QTL定位提供了方向。扁穗牛鞭草主要采用傳統(tǒng)育種方法,對(duì)表型進(jìn)行選擇,需要進(jìn)行多年多點(diǎn)觀測(cè),耗時(shí)長(zhǎng)效率低。本研究在扁穗牛鞭草表型研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)行SSR標(biāo)記與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析,篩選與重要農(nóng)藝性狀緊密關(guān)聯(lián)的SSR分子標(biāo)記,以期從分子水平解釋扁穗牛鞭草遺傳變異規(guī)律和機(jī)制,為篩選優(yōu)異種質(zhì)、加快育種進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1扁穗牛鞭草材料采自四川、重慶、云南、貴州等地不同生境、野生狀態(tài)下,外部形態(tài)差異明顯的扁穗牛鞭草無(wú)性系41份,及人工草地種植的國(guó)審品種“廣益”、“重高”、“雅安”(表1),每個(gè)無(wú)性系取具2~3個(gè)節(jié)的莖段種植于直徑為30 cm的塑料盆內(nèi),每盆1株,5個(gè)重復(fù)。
1.1.2試劑近緣植物高粱的SSR引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;植物DNA提取試劑盒、Taq酶、100 bp DNA Ladder、Mg2+、dNTPs購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;其他化學(xué)試劑購(gòu)自成都博瑞克生物技術(shù)有限公司。
1.2方法
1.2.1SSR分子標(biāo)記取幼嫩扁穗牛鞭草葉片,按植物DNA提取試劑盒步驟提取DNA。用0.8%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量。從50對(duì)SSR引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性好的10對(duì)引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系及程序按照WANG的方法[22]。用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離檢測(cè),照相觀察并記錄結(jié)果。
1.2.2農(nóng)藝性狀測(cè)定測(cè)定單株生物量、莖葉比、分蘗數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、節(jié)間長(zhǎng)、節(jié)直徑、莖長(zhǎng),其中單株生物量、莖葉比、分蘗數(shù)為5次重復(fù)結(jié)果,其他為15次重復(fù)結(jié)果。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì),在相同的遷移位置,有帶記為“1”,無(wú)帶記為“0”,僅記錄清晰強(qiáng)帶和重復(fù)性好的弱帶。根據(jù)標(biāo)記帶型的有無(wú)將群體劃分為2個(gè)亞群體:組1和組0,對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)分析[23],分析軟件為SPSS15.0。用組間方差與總方差的比值求得標(biāo)記產(chǎn)生的性狀變異占性狀總變異的百分率,即標(biāo)記對(duì)該性狀變異的貢獻(xiàn)率[18]。
2結(jié)果與分析
2.1農(nóng)藝性狀的表型變異
研究結(jié)果表明,所選擇扁穗牛鞭草群體的農(nóng)藝性狀存在較大變異(表3),其中分蘗數(shù)變異最大,變異系數(shù)達(dá)34.8%,其次是單株生物量、葉長(zhǎng)和莖葉比,變異系數(shù)也達(dá)20%以上,葉寬、節(jié)間長(zhǎng)、莖直徑、莖長(zhǎng)也存在不同程度的變異,變異系數(shù)分別為14.4%、17.3%、16.3%、16.2%。扁穗牛鞭草葉片最長(zhǎng)為28.9 cm,最短為10.4 cm;葉片寬度最大值為0.976 cm,最小值為0.475 cm;節(jié)間最長(zhǎng)為10.1 cm,最短為5.1 cm;莖直徑最大為0.571 cm,最小為0.278 cm;莖最長(zhǎng)為124.2 cm,莖最短為63.1 cm;單株分蘗數(shù)最多達(dá)227.3個(gè),最少達(dá)45.3個(gè);單株生物量最高達(dá)913.36 g,最少僅為281.34 g;莖葉比最高為5.1,最低為2.3。
2.2農(nóng)藝性狀表型相關(guān)
對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)分析,結(jié)果表明,扁穗牛鞭草的農(nóng)藝性狀間均存在顯著或極顯著相關(guān)。對(duì)牧草育種來(lái)說(shuō),單株生物量和莖葉比是最重要的兩個(gè)指標(biāo)。從表4可知,扁穗牛鞭草單株生物量與葉寬、莖直徑、莖長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān),莖葉比與節(jié)間長(zhǎng)、莖長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān),與分蘗數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)。利用單株生物量和莖葉比與形態(tài)指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系,可對(duì)扁穗牛鞭草種質(zhì)進(jìn)行初步篩選,選擇符合育種目標(biāo)的種質(zhì)作為進(jìn)一步育種的材料。
2.3SSR標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析
采用10對(duì)SSR引物,共擴(kuò)增出220條清晰、重復(fù)性好的條帶,片段大小為50~400 bp,其中多態(tài)性條帶為182條,多態(tài)率為82.7%,如SG5引物對(duì)的擴(kuò)增結(jié)果,見圖1。標(biāo)記位點(diǎn)與數(shù)量性狀的關(guān)聯(lián)分析采用單向分組資料的方差分析方法,即根據(jù)標(biāo)記帶型的有無(wú)將群體劃分為兩個(gè)亞群體——組1和組0,然后進(jìn)行單因素方差分析,獲得與數(shù)量性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)。通過(guò)單向分組資料的方差分析(表5),共檢測(cè)到與扁穗牛鞭草農(nóng)藝性狀極顯著相關(guān)的SSR標(biāo)記18?jìng)€(gè),其中有6個(gè)標(biāo)記分別與2個(gè)以上性狀關(guān)聯(lián),分別是SG5-160(葉長(zhǎng)、節(jié)間長(zhǎng)、莖長(zhǎng))、
SG15-127(葉寬、節(jié)間長(zhǎng)、莖直徑)、SG25-157(葉長(zhǎng)、葉寬、莖直徑)、SG7-220(分蘗數(shù)、單株生物量)、SG25-136(葉寬和莖直徑)、SG26-167(節(jié)間長(zhǎng)、莖長(zhǎng))。單個(gè)性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記在1~7個(gè)之間,莖直徑和單株分蘗數(shù)關(guān)聯(lián)的標(biāo)記最多,分別為7個(gè)和6個(gè);其次,葉寬、節(jié)間長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、葉長(zhǎng)關(guān)聯(lián)的標(biāo)記分別是4個(gè)、3個(gè)、3個(gè)和2個(gè),單株生物量和莖葉比關(guān)聯(lián)的標(biāo)記均為1個(gè)。每個(gè)標(biāo)記對(duì)性狀變異的貢獻(xiàn)率為15.1%~32.8%,SG5-160能解釋32.8%節(jié)間長(zhǎng)表型變異,引物SG25的SG25-157、SG25-136、SG25-125和SG25-118 4個(gè)標(biāo)記對(duì)莖直徑表型變異的總貢獻(xiàn)率達(dá)91.6%。
3結(jié)論與討論
目前,對(duì)多基因控制的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)的研究均是利用兩個(gè)具有多態(tài)性的種源(或家系)構(gòu)建分離群體進(jìn)行研究,但是這種人工創(chuàng)造的作圖群體所含的優(yōu)良目標(biāo)基因有限,構(gòu)建群體耗時(shí),效率低[6],而且對(duì)于無(wú)性繁殖的扁穗牛鞭草等植物,幾乎不可能得到這樣的分離群體。本研究采用野生扁穗牛鞭草無(wú)性系進(jìn)行分子標(biāo)記與數(shù)量性狀間的關(guān)聯(lián)分析,不僅避免了單一分離群體不易獲得的局限性,而且由于野生扁穗牛鞭草無(wú)性系來(lái)源廣泛、遺傳背景復(fù)雜,可能聚集較多的性狀基因,從而有望全面而系統(tǒng)地揭示出與扁穗牛鞭草農(nóng)藝性狀相關(guān)的QTL。本研究中,某些標(biāo)記同時(shí)與多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián),如SG5-160與葉長(zhǎng)、節(jié)間長(zhǎng)、莖長(zhǎng)關(guān)聯(lián),SG15-127與葉寬、節(jié)間長(zhǎng)、莖直徑關(guān)聯(lián),且各農(nóng)藝性狀間也彼此相關(guān)。性狀的相互關(guān)聯(lián)可能是由于控制該性狀的QTL相互連鎖或是某個(gè)QTL的一因多效造成的,同一標(biāo)記與多個(gè)相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)可能是數(shù)量性狀間在遺傳上相關(guān)造成的[24]。
連鎖不平衡(Linkage disquilibrium,LD)程度決定關(guān)聯(lián)分析的精度和所需標(biāo)記的數(shù)量、密度。通常異花授粉植物重組率高,LD衰減較快,需要較多的標(biāo)記;而自花授粉植物,特別是閉花授粉植物,DNA多態(tài)性偏低,重組率低,LD衰減距離大,關(guān)聯(lián)分析所需要的標(biāo)記少[25]。本研究從220個(gè)SSR標(biāo)記中找到18?jìng)€(gè)標(biāo)記與農(nóng)藝性狀極顯著相關(guān),這與扁穗牛鞭草依靠無(wú)性繁殖、LD衰減慢、LD程度較高、所采用的SSR標(biāo)記可能覆蓋了大部分基因組有關(guān)。
農(nóng)藝性狀是受多基因控制的數(shù)量性狀,且各性狀間均有一定的關(guān)聯(lián),通過(guò)常規(guī)育種技術(shù)對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行改良往往效果不顯著,且周期長(zhǎng)。在DNA水平上利用分子標(biāo)記輔助選擇育種對(duì)農(nóng)藝性狀、抗性等重要性狀進(jìn)行早期選擇是很有前景的領(lǐng)域。本研究采用SSR分子標(biāo)記對(duì)扁穗牛鞭草材料進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)18?jìng)€(gè)與扁穗牛鞭草農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記,其中SG5-160對(duì)節(jié)間長(zhǎng)變異的貢獻(xiàn)率達(dá)32.8%,引物SG25的4個(gè)標(biāo)記(SG25-157、SG25-136、SG25-125和SG25-118)對(duì)莖直徑表型變異的總貢獻(xiàn)率達(dá)91.6%。利用與主要農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記可對(duì)大量扁穗牛鞭草種質(zhì)進(jìn)行篩選,可在早期發(fā)現(xiàn)優(yōu)異種質(zhì),降低成本和工作量,這在扁穗牛鞭草新品種培育中有重要意義。
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