一種通用的質粒構建方法的探索

摘 要:PCR產物與克隆載體連接是基因克隆環節中重要的一步。文章介紹了一種簡便、通用的質粒構建方法。此法是在PCR引物設計時，在目的片段5′端加上BsaI序列，然后通過BsaI酶切產生具有相同粘性末端的載體和插入片段，經過連接，獲得重組質粒。

關鍵詞:質粒構建 反向PCR BsaI 無縫連接

中圖分類號:Q782文獻標識碼:A文章編號:1674-098X(2011)04(b)-0085-02

A Universal throughput Method of Constructing Plasmids

(Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620，China)

Abstract:The article describes a simple and throughput method to construct plasmid.The method is to add the sequence of BsaI to 5' primer end，producing vectors and inserts with the same cohesive terminus by BsaI digestion，and at last to get recombinant plasmids by ligation.

Key words:plasmid construction;reverse PCR;BsaI;Seamless ligation

質粒構建技術是基因工程常用的技術之一，即將一段需要克隆的外源DNA片段插入到載體DNA分子中形成重組DNA分子，然后將該重組載體轉運到宿主細胞中[1，2]，常規質粒的構建方法是在插入片段和載體兩端分別尋找相同的酶切位點，即雙酶切后可以產生相同的粘性末端[3，4]。本方法克服了這個局限性，通過利用BsaI酶切特點實現了載體與插入片段的無縫連接。本實驗以載體pKH和DNA片段CP(一種蛋白質內含子的編碼基因)為例介紹這種通用并且簡便的質粒構建方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以質粒pKH作為構建質粒的載體，pMCP含有編碼CP的基因。質粒pKH(3516bp)和pMCP來自加拿大DalhousieUniversityPaulLiu教授實驗室，含有氨芐青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，常被用來作為分子生物學試驗的載體。本實驗中所選擇的pKH的插入位點位于卡那霉素抗性基因中(圖1)。

1.2 引物設計與合成

圖2(A)展示了BsaI酶切位點，它的識別序列與切割序列不一致，它在識別序列后的第一位堿基和互補鏈的第五位堿基切割。在載體的插入位點處設計一對含有BsaI酶切位點的引物，對載體進行反向PCR，引物5'端加上BsaI酶切序列和保護堿基，另外還需要補充目的片段末端的四個堿基。在本實驗中，對載體pKH進行反向PCR設計的引物為pKHA和pKHB(圖2中B)，從5'3'依次是保護堿基(ATC)，BsaI酶切序列(陰影部分)，插入片段CP端的四個堿基(小寫部分)，以及與載體互補序列(劃線部分)。對插入片段擴增的一對引物包括保護堿基，BsaI酶切序列以及與插入片段互補的序列。如圖2(C)所示，本實驗用于PCR擴增CP的引物CPb1和CPb2包括了保護堿基(ATC)，BsaI酶切序列(陰影部分)，插入片段互補序列(劃線部分)。

1.3 環形載體質粒和插入片段制備

對回收的反向PCR產物磷酸化后自連，轉化感受態細胞，涂含有100?μg/mlAmp的LB平板，37℃培養12h，挑取單克隆，在含有100μg/mlAmp的液體LB培養基中培養，150r/min，37℃培養12h，提取質粒pKH'。BsaI酶切驗證環形載體pKH'的正確性，并對酶切正確的質粒測序。

BsaI酶切環形載體便可獲得用于質粒構建的線性載體。對PCR擴增的CP片段也利用BsaI酶切，獲得插入片段。

1.4 獲得重組質粒

所獲得的載體與插入片段具有相同的粘性末端，用T4DNA連接酶連接即可獲得重組質粒。

2 結果

2.1 環形載體獲得

通過含有BsaI引物反向PCR質粒pKH，然后磷酸化，自連，轉化感受態細胞獲得環形載體，利用BsaI酶切可初步驗證其正確。如圖3所示，泳道1為陽性對照(3516bp)環形載體pKH'由于含有了BsaI酶切位點，經過BsaI酶切、電泳，呈現線性DNA的條帶(泳道3和4，3520bp)，而原始pKH不含有BsaI，表現為質粒條帶(泳道2和5)。

2.2 酶切環形載體和插入片段

對獲得的環形載體和擴增的CP均用BsaI酶切，可獲得含有相同粘性末端的載體和插入片段(圖4陰影部分為酶切后獲得片段)。

兩者連接便可獲得重組質粒，這樣利用了BsaI酶切的特點，使插入片段和載體達到了無縫連接的目的。

3 討論

利用此法構建質粒具有以下優點:其一，常規的質粒構建，需要尋找合適的酶切序列，使插入片段和載體具有相同的粘性末端，而利用這種方法只需要通過PCR引入BsaI序列，酶切便可產生相同粘性末端，具有更好的通用性和簡便性[1，5];其二，如果需要制備大量的載體，這種方法也具有顯著優勢。由于利用含有BsaI序列的引物反向PCR，然后磷酸化，自連，轉化，液體培養菌體，可獲得大量的環形載體，然后再利用BsaI酶切就可獲得大量線性載體片段。與反復通過反向PCR獲得載體的策略相比更高效，準確率也更高[6，7，8]。需要注意的是，對于一些本身含有BsaI酶切位點的載體，首先需要把BsaI酶切位點突變，然后利用本策略。

總之，利用BsaI無縫連接的方法是一種簡便、通用、高效質粒構建方法。

致謝:感謝我的導師孟清教授的悉心指導和加拿大DalhousieUniversity，PaulXiang-QinLiu教授提供實驗材料。

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