基因組改組構(gòu)建柔紅霉素高產(chǎn)菌株

摘 要:目的:構(gòu)建高產(chǎn)菌株，提高柔紅霉素發(fā)酵效價(jià)。方法:使用基因組改組法，用搖瓶測(cè)試發(fā)酵效價(jià)。結(jié)果:使柔紅霉素效價(jià)提高105%。結(jié)論:使用基因組改組的方法可以大幅度的提高柔紅霉素發(fā)酵效價(jià)。

關(guān)鍵詞:柔紅霉素菌株基因組重排

中圖分類號(hào):R2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1674-098X(2011)08(b)-0051-02

臨床上鹽酸柔紅霉素是治療急性非淋巴細(xì)胞性白血病的一線藥物，對(duì)兒童白血病也有良好的緩解作用，30年沒(méi)有被其他藥物取代。在制藥領(lǐng)域是去甲氧柔紅霉素、阿霉素和表阿霉素的合成起始原料。隨著人類的癌癥發(fā)病率逐年提高，鹽酸柔紅霉素的市場(chǎng)容量也在快速上升，2009年被收錄到《國(guó)家基本醫(yī)療保險(xiǎn)藥品目錄》。然而較低的發(fā)酵效價(jià)造成了昂貴的生產(chǎn)成本，致使售價(jià)居高不下。降低生產(chǎn)成本，減少患者的負(fù)擔(dān)是我們當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。

2002年建立的基因組改組(genome shuffling)技術(shù)，應(yīng)用多親本遞近融合(recursive fusion)，定向篩選具有重要表型特征改變的突變體，已經(jīng)成功地用于工業(yè)微生物多基因控制表型的改良[1～4]。高雯采用紫外誘變和基因組改組相結(jié)合的方法構(gòu)建柔紅霉素高產(chǎn)菌株，使發(fā)酵單位提高60%[5]。劉連碧等使用鏈霉素抗性篩選法，提高柔紅霉素發(fā)酵單位50%[6]。本次研究將采用鹽酸胍和紫外聯(lián)合誘變與基因組改組相結(jié)合的方法，并使用鏈霉素抗性篩選法進(jìn)行柔紅霉素高產(chǎn)菌株的構(gòu)建。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

親本:S-07A:發(fā)酵效價(jià)為1000mg/L。保存于魯南制藥科研部。

1.1.2 融合培養(yǎng)基及試劑[7]

亞硝基胍(NTG)，甲醇(AR)，0.9%生理鹽水，YEME液體培養(yǎng)基，10.3%蔗糖溶液，TSA平板，P緩沖液，10mg/ml溶菌酶溶液(用P緩沖液溶解)，25% PEG4000(用P緩沖液溶解)，R2軟瓊脂，R2YE平板。

TM緩沖液(Tris-馬來(lái)酸緩沖液):Tris0.121g，馬來(lái)酸0.116g，純化水20ml調(diào)節(jié)pH6.0，121℃滅菌5min。

種子搖瓶培養(yǎng)基:玉米淀粉4.0％，葡萄糖1.0％，麩皮1.0％，麩質(zhì)粉0.5％，KH2PO4 0.1％，(NH4)2SO4 0.1％，CaCO3 0.4％，pH自然。裝60ml于500ml搖瓶中，121℃滅菌30min。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基:玉米淀粉7.0%，麩皮1.0%，麩質(zhì)粉0.5%，KH2PO4 0.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%;pH自然。裝30ml于250ml搖瓶中，121℃滅菌30min。

1.1.3色譜條件

高壓液相色譜Agilent C18色譜柱(53mm*7mm，3μm);流動(dòng)相:15mmol/L的磷酸二氫鉀－乙腈(1∶1);柱溫25℃;流速1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254nm。

1.2 方法

1.2.1 菌種誘變

取菌種S-07A甘油管2支融化后分別用紫外和NTG進(jìn)行誘變。紫外誘變:15W，254nm，距離30cm紫外燈下，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)誘變1min。將菌液離心，棄上清，用生理鹽水懸浮為2ml菌液。NTG誘變:將菌液離心，棄上清，加入1ml TM緩沖液，分散均勻，稱取1mg NTG并用1滴甲醇溶解后加入菌絲懸浮液中，于30℃搖床中220rpm誘變120min。將菌液離心，棄上清，用生理鹽水洗滌3次后懸浮為2ml菌液。

1.2.2 菌絲體制備

將2種經(jīng)過(guò)誘變的菌種都進(jìn)行以下操作:接種菌液2ml于裝量60ml含6μg/ml鏈霉素YEME的500ml三角瓶中，于29℃搖床中220rpm培養(yǎng)42h。吸取菌液3ml接種于裝量30ml含有0.5%甘氨酸的YEME250ml三角瓶中，于29℃搖床中220rpm培養(yǎng)42h。鏡檢確定無(wú)菌。

將菌液倒入50ml無(wú)菌離心管，5000rpm，10min，棄上清。用10ml 10.3%蔗糖溶液洗滌菌絲體一次，棄上清。再加10ml 10.3%蔗糖溶液用漩渦振蕩將菌絲分散均勻，分裝于1.5ml離心管中，每管裝1ml。取1管涂布TSA平板作無(wú)菌檢查。其他管離心，棄上清，于-20℃保存。

1.2.3 原生質(zhì)體制備

取3個(gè)小離心管，用1ml P緩沖液分散菌絲、洗滌、離心、棄上清。加800μl P緩沖液漩渦振蕩使菌絲分散均勻，再加入200μl 10mg/ml溶菌酶溶液，充分混勻，于30℃水浴酶解90min。500rpm離心5min，將上部原生質(zhì)體懸浮液轉(zhuǎn)移到另一只無(wú)菌1.5ml離心管中，3000rpm離心10min沉淀原生質(zhì)體，棄上清。用1ml P緩沖液洗滌一次，棄上清。加500μl P緩沖液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并配成107個(gè)/ml的原生質(zhì)體溶液。

1.2.4 原生質(zhì)體滅活

將紫外誘變和NTG誘變菌株原生質(zhì)體等量混合后分為2份，取1份置于60℃水浴中處理120min滅活，另一份置于冰水浴中處理120min。

1.2.5 原生質(zhì)體融合

將2種不同處理的菌液混合，3000rpm離心10min，棄上清。然后加入1ml P緩沖液，充分懸浮，3000rpm離心10min，棄上清。重復(fù)以上步驟一次。徹底甩干留在管底的液滴。

輕敲管壁，打散沉淀。加入0.5ml 25% PEG4000(30℃水浴保溫)，充分懸浮。室溫放置1min。加0.5ml P緩沖液稀釋，3000rpm離心10min，棄上清。用P緩沖液洗滌一次，3000rpm離心10min，棄上清。加入100μl P緩沖液，懸浮原生質(zhì)體，與4mlR2軟瓊脂(50℃水浴保溫)混合，迅速傾注在R2YE平板上，28℃恒溫培養(yǎng)至菌絲體較稠密。

將上述R2YE平板軟瓊脂再生菌層用接種鏟刮下來(lái)，梯度稀釋，接種到含12μg/ml鏈霉素的R2YE平板上，28℃恒溫培養(yǎng)至長(zhǎng)出成熟菌落。挑取紅色園斑大者為第一輪融合結(jié)果G1。

1.2.6 雜合子代原生質(zhì)體的制備、融合及篩選。

將上一次融合并篩選后的多個(gè)菌株(G1)繼續(xù)進(jìn)行下一輪的原生質(zhì)體制備、滅活、融合與再生，所得菌落梯度稀釋后經(jīng)18μg/ml鏈霉素的R2YE平板篩選，所得菌株即G2。以未經(jīng)PEG處理的每一輪原生質(zhì)體再生菌株作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始菌株篩選

本研究采用紫外和NTG誘變，對(duì)S-07A進(jìn)行處理，通過(guò)鏈霉素抗性平板進(jìn)行篩選，得到3株紫外誘變菌株(Dau UV1-3)和4株NTG誘變菌株(Dau NTG1-4)，以此作為初始菌株進(jìn)行基因組改組。

2.2 基因組改組

將第一輪融合子涂布到含12μg/ml鏈霉素的R2YE平板上，挑選8株紅色斑點(diǎn)大的菌株，即第一輪改組菌株(Dau G11-18)。將所得8個(gè)G1菌株按同樣的策略進(jìn)行培養(yǎng)，制備原生質(zhì)體，融合，再生后在更高鏈霉素濃度18μg/ml R2YE平板篩選，獲得4個(gè)第二輪改組菌株庫(kù)(Dau G21-24)。

將S-07A、Dau UV、Dau NTG)與Dau G2分別于0μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、18μg/ml鏈霉素平板上培養(yǎng)。結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果表明第二輪改組菌株對(duì)鏈霉素的抗性最強(qiáng)，比原始菌株提高了18μg/ml。

2.3 搖瓶發(fā)酵效價(jià)比較

將S-07A、Dau UV、Dau NTG與Dau G2分別于種子搖瓶培養(yǎng)基中，接種量1ml，于29℃搖床中220rpm培養(yǎng)42h。再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，接種量10%，每個(gè)菌株接種9個(gè)搖瓶，于28℃搖床中220rpm培養(yǎng)156、168、180h。高壓液相測(cè)定效價(jià)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定3個(gè)搖瓶，結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)果表明不論誘變還是基因組改組都能夠提高發(fā)酵效價(jià)，基因組改組效果最好，其中Dau G22發(fā)酵效價(jià)最高，最高效價(jià)為2254g/L，比原始菌株提高105%。

2.4 融合子的穩(wěn)定性試驗(yàn)

選擇效價(jià)最高的2個(gè)融合子:Dau G21和Dau G22，傳代20次后，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵，用高壓液相測(cè)定發(fā)酵效價(jià)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果證明融合子Dau G21和Dau G22遺傳穩(wěn)定性都很好。

3 結(jié)語(yǔ)

我們采用紫外和NTG兩種誘變方法獲得多株突變菌株作為基因組改組的出發(fā)菌株擴(kuò)大了遺傳差異性，融合滅活后的原生質(zhì)體可以提高融合子的篩選效率，采用遞進(jìn)式的鏈霉素篩選壓力是優(yōu)化柔紅霉素產(chǎn)生菌的有效方式，多輪原生質(zhì)體融合是基因組改組的有效方法。基因組改組技術(shù)是提高工業(yè)微生物發(fā)酵效價(jià)的重要手段，有著廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

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[4]Dai M H， Copley S D. Genome shuffling improves degradation of the anthropogenic pesticide Pentachlo RophenolbySphingobium chlorophenolicum ATCC 39723.Appl Environ Microbiol，2004，70:2391～2397.

[5]高雯.抗腫瘤抗生素柔紅霉素產(chǎn)生菌的基因組改組研究.中國(guó)優(yōu)秀碩士論文庫(kù).2005.

[6]劉連碧，曹進(jìn)新，朱春寶，朱寶泉.鏈霉素抗性篩選法在柔紅霉素產(chǎn)生菌S.coeruleorubidus Var.zhengding SIPI 1482菌種選育中的應(yīng)用.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志.2000.31(8):345～347.

[7]T Kieser，MJ Bibb， MJ Buttner，KF Chater， DA Hopwood.《practical streptomyces genetics》.Published by the John Innes Foundation.2000.