豬瘟-豬藍(lán)耳病-豬圓環(huán)2型三聯(lián)高免血清的制備

摘要：進(jìn)行了制備豬瘟－豬藍(lán)耳病－豬圓環(huán)２型三聯(lián)高免血清的試驗。試驗采用三種疫苗對試驗牛只進(jìn)行多次免疫后，對其進(jìn)行頸靜脈采血和分離血清，并對所制備的高免血清進(jìn)行無菌檢驗和安全性試驗，通過間接ＥＬＳＩＡ檢測血清中的豬瘟、豬藍(lán)耳、豬圓環(huán)病毒三種抗體的效價。結(jié)果顯示，豬瘟、豬藍(lán)耳、豬圓環(huán)病毒抗體效價分別達(dá)到１∶２ ０５６、１∶１ ２８０、１∶１ ２８０，獲得的三聯(lián)血清無菌，且對仔豬安全，該血清有望為豬瘟、豬藍(lán)耳病和豬圓環(huán)病的防治提供理想的生物制劑。關(guān)鍵詞：高免血清；免疫抑制；疫苗

中圖分號號：Ｓ８５９．７９＋７ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０11）11-0006-02

經(jīng)過多年的努力，我國養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)水平已有了長足發(fā)展，但是隨著國外豬種的引入，國內(nèi)各豬場種豬調(diào)運頻繁，許多豬病由原來的單一病原轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘁蜃訁f(xié)同作用，加之免疫程序不當(dāng)，疫苗質(zhì)量良莠不齊等因素，使得豬病越來越復(fù)雜，尤其是免疫抑制性疾病為主的混合感染，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失［１］。免疫抑制性疾病對養(yǎng)豬生產(chǎn)造成的危害已引起了獸醫(yī)科技工作者的廣泛關(guān)注，目前研究確定的免疫抑制性病毒有豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病毒、豬圓環(huán)病毒2型等，它們感染豬以后不僅造成原發(fā)病變，導(dǎo)致豬的免疫功能下降，從而繼發(fā)感染其他疾病，還能致使常規(guī)疫苗接種后無法達(dá)到預(yù)期效果。而在規(guī)模化豬場疫病發(fā)生早期，高免血清配合疫苗使用是防控疾病的有效措施之一［２］。由于高免血清中含有較高的針對病原的特異性抗體，能與體內(nèi)相應(yīng)病原發(fā)生特異性中和作用，從而能有效地抑制免疫抑制性病原的致病作用，使機(jī)體恢復(fù)健康［３］。

針對目前普遍存在的豬瘟＋豬藍(lán)耳病＋豬圓環(huán)病混合感染的現(xiàn)狀，本研究擬篩選市場上保護(hù)效果良好的豬瘟疫苗、高致病性豬藍(lán)耳病疫苗和豬圓環(huán)病毒2型疫苗制備三聯(lián)異源高免血清。該血清可為快速控制疫病的蔓延、減少養(yǎng)殖企業(yè)的損失提供新的方法，并對同類疾病的預(yù)防及治療具有積極的示范作用。

１材料和方法

１．１試驗動物

４頭１歲齡健康奶牛，體重３００～４００ｋｇ，武漢金旭畜牧科技發(fā)展有限公司提供。５頭１月齡健康仔豬，用于安全性試驗，由博牧試驗豬場提供。

１．２試驗疫苗

豬瘟５０萬倍活疫苗（細(xì)胞源，２０頭份／瓶），高致病性豬藍(lán)耳病滅活疫苗（ＮＶＤＣ－ＪＸＡ１株，１００ｍＬ／瓶），購于武漢中博生物股份有限公司；豬圓環(huán)病毒２型滅活苗，購于武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司。

１．３試驗儀器和試劑

冷凍離心機(jī)（長沙平凡儀器廠），酶標(biāo)儀（Ｂｉｏ－Ｒａｄ），豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒２型ＥＬＩＳＡ抗體檢測試劑盒（武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司）。兔抗牛酶標(biāo)二抗（ＳＩＧＭＡ公司）。青霉素（１６０萬Ｕ/瓶，２０瓶），鏈霉素（１００萬Ｕ/瓶，２０瓶），硫柳汞（０．０１％，２０ｍＬ）。

１．４免疫程序

首次免疫前采集空白牛血樣作陰性對照。

首次免疫分別于試驗牛頸部和腿部肌肉多點注射豬瘟弱毒疫苗（２０頭份／頭）。首免后兩周以相同方式進(jìn)行二免（８０頭份／頭）。二免后兩周以相同方式進(jìn)行三免（２００頭份／頭）。三免后兩周，相同方式進(jìn)行四免（４００頭份／牛）。

豬瘟弱毒疫苗首免第５天后，分別于試驗牛頸部、腿部肌肉分點注射豬藍(lán)耳病滅活疫苗（４０ｍＬ／牛），首免后兩周以相同方式進(jìn)行二免（１６０ｍＬ／牛）。二免后兩周以相同方式進(jìn)行三免（４００ｍＬ／牛）。三免后兩周以相同方式進(jìn)行四免（8００ｍＬ／牛）。

豬瘟弱毒疫苗首免后第９天，分別于試驗牛頸部、腿部肌肉分點注射豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗（４０ｍＬ／牛），首免后兩周以相同方式進(jìn)行二免（１６０ｍＬ／牛）。二免后兩周以相同方式進(jìn)行三免（４００ｍＬ／牛）。三免后兩周以相同方式進(jìn)行四免（８００ｍＬ／牛）。

１．５高免血清的制備

每次免疫前均少量采血檢測其抗體效價水平，當(dāng)血清抗體效價達(dá)到要求時，對牛進(jìn)行頸靜脈采血。用離心管采集血液，于低溫離心機(jī)３ ０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ。取上清，加入雙抗（每毫升加入毒霉素、鏈霉素各１ ０００Ｕ）和0.01%的硫柳汞，部分少量分裝，

－２０℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

１．６兔抗牛酶標(biāo)二抗稀釋濃度摸索、血清效價檢測和安全性試驗

兔抗牛酶標(biāo)二抗稀釋濃度摸索：將預(yù)試驗中獲得的間接血凝效價為１∶８的牛血清作為一抗，采集陰性血清為對照，利用購買的ＥＬＩＳＡ試劑盒并參照說明書進(jìn)行二抗稀釋濃度的摸索（湖北省動物疫病防控中心），結(jié)果見表１。由表1可見，在二抗稀釋濃度為１∶１５ ０００時，陽性血清ＯＤ630nm值達(dá)到要求，且Ｐ／Ｎ值（陽性血清／陰性血清）最高，確定為二抗稀釋濃度。

血清效價的檢測：利用豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒２型ＥＬＩＳＡ抗體檢測試劑盒對血清分別進(jìn)行檢測，操作方法和判斷方法均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

血清無菌性檢測：將制備的三聯(lián)血清接種于普通瓊脂平板和血斜面培養(yǎng)基，置３７℃水浴鍋培養(yǎng)４８ｈ，觀察結(jié)果。

安全性試驗：選５頭１月齡健康仔豬，每頭接種１０ｍＬ高免血清后觀察仔豬的健康狀況。

２結(jié)果

２．１三種疫苗免疫效價檢測結(jié)果

檢測結(jié)果見表２、表３、表４。由表中可見，將制備的血清從１∶４０倍開始稀釋，豬瘟、豬藍(lán)耳、豬圓環(huán)血清分別倍比稀釋到１∶２ ５６０、１∶１ ２８０、１∶１ ２８０仍為陽性。對照組血清作為陰性對照，采用間接ＥＬＩＳＡ方法測定其抗體效價，參照試劑盒說明書，陽性與陰性對照比值為３以上，ＯＤ630nm≥０．４２時對應(yīng)的稀釋度為其血清效價。

２．２無菌性檢驗和安全性試驗

（１）將制備的三聯(lián)血清分別接種普通瓊脂平板和血斜面培養(yǎng)基，４８ｈ后均無任何細(xì)菌生長。

（２）仔豬接種高免血清后，精神狀態(tài)良好，食欲正常，表明該血清對仔豬是安全的。

３討論

近年來，我國豬病流行呈現(xiàn)老病新病混合感染，病毒性疾病逐漸成為主體，并且非典型病例日趨增多等越來越復(fù)雜的趨勢，尤其針對于目前具有免疫抑制性的病毒性疾病（豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒病等）［4，5］，疫苗和藥物往往無法達(dá)到應(yīng)有的效果，尤其是因免疫抑制性疾病病原體的變異而引發(fā)的繼發(fā)感染更是給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。規(guī)模化養(yǎng)豬生產(chǎn)中對該類疫病暴發(fā)時緊急控制有效的措施之一就是疫苗和高免血清的配合使用［6］。目前市場上豬瘟血清存在抗體效價不穩(wěn)定的缺點，而豬藍(lán)耳病和豬圓環(huán)病毒病目前還沒有商品化血清，因而遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實際生產(chǎn)需要。由此可見，生產(chǎn)效價高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特異性多聯(lián)抗血清很有必要。

豬高免血清多由同源動物（豬）制備，在當(dāng)前疫病復(fù)雜的情況下，使用一般的商品豬制備血清可能帶有其他病原而引發(fā)交叉感染，而利用異源大動物制備高免血清盡管能擴(kuò)大血清產(chǎn)量，又存在效價不高的問題。除上述考慮外，在試驗中我們選擇１歲左右的奶牛為血清供體，主要是因為成年奶牛乳房炎發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響母牛在試驗過程中的健康狀況，同時母牛生產(chǎn)也會對試驗造成影響。

免疫程序的合理制定是高效價免疫血清制備的關(guān)鍵［７］。為了降低疫苗之間的相互影響，且避免同時注射大劑量抗原時所帶來的應(yīng)激反應(yīng)，我們把疫苗接種的時間相互錯開５ｄ。研究中所使用的抗原均是疫苗，沒有考慮使用強(qiáng)毒接種，很大程度上是考慮到可能散毒的危險。豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒病疫苗的血清抗體效價明顯低于豬瘟的免疫抗體效價，可能是由于免疫佐劑局限性導(dǎo)致免疫效果大打折扣。同時在加強(qiáng)免疫的次數(shù)、時間間隔、采血的時間上也沒有做更多的對比試驗，主要是受不能影響受試養(yǎng)殖場正常生產(chǎn)的實際情況的限制，如能在進(jìn)一步的研究中通過對比試驗摸索最佳條件將會獲得更好的效果。

效價檢測結(jié)果顯示，本研究中的血清制品具有高效價、多聯(lián)的優(yōu)勢。無菌檢驗、安全性試驗的結(jié)果表明血清對仔豬無任何不良反應(yīng)，理論上有著良好的臨床治療應(yīng)用價值，但實際的臨床應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步驗證。

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