豬瘟-豬藍耳病-豬圓環2型三聯高免血清的制備

摘要：進行了制備豬瘟－豬藍耳病－豬圓環２型三聯高免血清的試驗。試驗采用三種疫苗對試驗牛只進行多次免疫后，對其進行頸靜脈采血和分離血清，并對所制備的高免血清進行無菌檢驗和安全性試驗，通過間接ＥＬＳＩＡ檢測血清中的豬瘟、豬藍耳、豬圓環病毒三種抗體的效價。結果顯示，豬瘟、豬藍耳、豬圓環病毒抗體效價分別達到１∶２ ０５６、１∶１ ２８０、１∶１ ２８０，獲得的三聯血清無菌，且對仔豬安全，該血清有望為豬瘟、豬藍耳病和豬圓環病的防治提供理想的生物制劑。關鍵詞：高免血清；免疫抑制；疫苗

中圖分號號：Ｓ８５９．７９＋７ 文獻標識碼：A 文章編號：１００７－２７３Ｘ（２０11）11-0006-02

經過多年的努力，我國養豬業生產水平已有了長足發展，但是隨著國外豬種的引入，國內各豬場種豬調運頻繁，許多豬病由原來的單一病原轉變為多因子協同作用，加之免疫程序不當，疫苗質量良莠不齊等因素，使得豬病越來越復雜，尤其是免疫抑制性疾病為主的混合感染，給我國的養豬業造成了巨大的損失［１］。免疫抑制性疾病對養豬生產造成的危害已引起了獸醫科技工作者的廣泛關注，目前研究確定的免疫抑制性病毒有豬瘟病毒、豬藍耳病毒、豬圓環病毒2型等，它們感染豬以后不僅造成原發病變，導致豬的免疫功能下降，從而繼發感染其他疾病，還能致使常規疫苗接種后無法達到預期效果。而在規模化豬場疫病發生早期，高免血清配合疫苗使用是防控疾病的有效措施之一［２］。由于高免血清中含有較高的針對病原的特異性抗體，能與體內相應病原發生特異性中和作用，從而能有效地抑制免疫抑制性病原的致病作用，使機體恢復健康［３］。

針對目前普遍存在的豬瘟＋豬藍耳病＋豬圓環病混合感染的現狀，本研究擬篩選市場上保護效果良好的豬瘟疫苗、高致病性豬藍耳病疫苗和豬圓環病毒2型疫苗制備三聯異源高免血清。該血清可為快速控制疫病的蔓延、減少養殖企業的損失提供新的方法，并對同類疾病的預防及治療具有積極的示范作用。

１材料和方法

１．１試驗動物

４頭１歲齡健康奶牛，體重３００～４００ｋｇ，武漢金旭畜牧科技發展有限公司提供。５頭１月齡健康仔豬，用于安全性試驗，由博牧試驗豬場提供。

１．２試驗疫苗

豬瘟５０萬倍活疫苗（細胞源，２０頭份／瓶），高致病性豬藍耳病滅活疫苗（ＮＶＤＣ－ＪＸＡ１株，１００ｍＬ／瓶），購于武漢中博生物股份有限公司；豬圓環病毒２型滅活苗，購于武漢科前動物生物制品有限責任公司。

１．３試驗儀器和試劑

冷凍離心機（長沙平凡儀器廠），酶標儀（Ｂｉｏ－Ｒａｄ），豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒２型ＥＬＩＳＡ抗體檢測試劑盒（武漢科前動物生物制品有限責任公司）。兔抗牛酶標二抗（ＳＩＧＭＡ公司）。青霉素（１６０萬Ｕ/瓶，２０瓶），鏈霉素（１００萬Ｕ/瓶，２０瓶），硫柳汞（０．０１％，２０ｍＬ）。

１．４免疫程序

首次免疫前采集空白牛血樣作陰性對照。

首次免疫分別于試驗牛頸部和腿部肌肉多點注射豬瘟弱毒疫苗（２０頭份／頭）。首免后兩周以相同方式進行二免（８０頭份／頭）。二免后兩周以相同方式進行三免（２００頭份／頭）。三免后兩周，相同方式進行四免（４００頭份／牛）。

豬瘟弱毒疫苗首免第５天后，分別于試驗牛頸部、腿部肌肉分點注射豬藍耳病滅活疫苗（４０ｍＬ／牛），首免后兩周以相同方式進行二免（１６０ｍＬ／牛）。二免后兩周以相同方式進行三免（４００ｍＬ／牛）。三免后兩周以相同方式進行四免（8００ｍＬ／牛）。

豬瘟弱毒疫苗首免后第９天，分別于試驗牛頸部、腿部肌肉分點注射豬圓環病毒2型滅活疫苗（４０ｍＬ／牛），首免后兩周以相同方式進行二免（１６０ｍＬ／牛）。二免后兩周以相同方式進行三免（４００ｍＬ／牛）。三免后兩周以相同方式進行四免（８００ｍＬ／牛）。

１．５高免血清的制備

每次免疫前均少量采血檢測其抗體效價水平，當血清抗體效價達到要求時，對牛進行頸靜脈采血。用離心管采集血液，于低溫離心機３ ０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ。取上清，加入雙抗（每毫升加入毒霉素、鏈霉素各１ ０００Ｕ）和0.01%的硫柳汞，部分少量分裝，

－２０℃冷凍保存備用。

１．６兔抗牛酶標二抗稀釋濃度摸索、血清效價檢測和安全性試驗

兔抗牛酶標二抗稀釋濃度摸索：將預試驗中獲得的間接血凝效價為１∶８的牛血清作為一抗，采集陰性血清為對照，利用購買的ＥＬＩＳＡ試劑盒并參照說明書進行二抗稀釋濃度的摸索（湖北省動物疫病防控中心），結果見表１。由表1可見，在二抗稀釋濃度為１∶１５ ０００時，陽性血清ＯＤ630nm值達到要求，且Ｐ／Ｎ值（陽性血清／陰性血清）最高，確定為二抗稀釋濃度。

血清效價的檢測：利用豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒２型ＥＬＩＳＡ抗體檢測試劑盒對血清分別進行檢測，操作方法和判斷方法均按照試劑盒說明書進行。

血清無菌性檢測：將制備的三聯血清接種于普通瓊脂平板和血斜面培養基，置３７℃水浴鍋培養４８ｈ，觀察結果。

安全性試驗：選５頭１月齡健康仔豬，每頭接種１０ｍＬ高免血清后觀察仔豬的健康狀況。

２結果

２．１三種疫苗免疫效價檢測結果

檢測結果見表２、表３、表４。由表中可見，將制備的血清從１∶４０倍開始稀釋，豬瘟、豬藍耳、豬圓環血清分別倍比稀釋到１∶２ ５６０、１∶１ ２８０、１∶１ ２８０仍為陽性。對照組血清作為陰性對照，采用間接ＥＬＩＳＡ方法測定其抗體效價，參照試劑盒說明書，陽性與陰性對照比值為３以上，ＯＤ630nm≥０．４２時對應的稀釋度為其血清效價。

２．２無菌性檢驗和安全性試驗

（１）將制備的三聯血清分別接種普通瓊脂平板和血斜面培養基，４８ｈ后均無任何細菌生長。

（２）仔豬接種高免血清后，精神狀態良好，食欲正常，表明該血清對仔豬是安全的。

３討論

近年來，我國豬病流行呈現老病新病混合感染，病毒性疾病逐漸成為主體，并且非典型病例日趨增多等越來越復雜的趨勢，尤其針對于目前具有免疫抑制性的病毒性疾病（豬瘟、豬藍耳病、豬圓環病毒病等）［4，5］，疫苗和藥物往往無法達到應有的效果，尤其是因免疫抑制性疾病病原體的變異而引發的繼發感染更是給養豬業造成了巨大損失。規模化養豬生產中對該類疫病暴發時緊急控制有效的措施之一就是疫苗和高免血清的配合使用［6］。目前市場上豬瘟血清存在抗體效價不穩定的缺點，而豬藍耳病和豬圓環病毒病目前還沒有商品化血清，因而遠遠不能滿足實際生產需要。由此可見，生產效價高、穩定性強的特異性多聯抗血清很有必要。

豬高免血清多由同源動物（豬）制備，在當前疫病復雜的情況下，使用一般的商品豬制備血清可能帶有其他病原而引發交叉感染，而利用異源大動物制備高免血清盡管能擴大血清產量，又存在效價不高的問題。除上述考慮外，在試驗中我們選擇１歲左右的奶牛為血清供體，主要是因為成年奶牛乳房炎發病率較高，嚴重影響母牛在試驗過程中的健康狀況，同時母牛生產也會對試驗造成影響。

免疫程序的合理制定是高效價免疫血清制備的關鍵［７］。為了降低疫苗之間的相互影響，且避免同時注射大劑量抗原時所帶來的應激反應，我們把疫苗接種的時間相互錯開５ｄ。研究中所使用的抗原均是疫苗，沒有考慮使用強毒接種，很大程度上是考慮到可能散毒的危險。豬藍耳病、豬圓環病毒病疫苗的血清抗體效價明顯低于豬瘟的免疫抗體效價，可能是由于免疫佐劑局限性導致免疫效果大打折扣。同時在加強免疫的次數、時間間隔、采血的時間上也沒有做更多的對比試驗，主要是受不能影響受試養殖場正常生產的實際情況的限制，如能在進一步的研究中通過對比試驗摸索最佳條件將會獲得更好的效果。

效價檢測結果顯示，本研究中的血清制品具有高效價、多聯的優勢。無菌檢驗、安全性試驗的結果表明血清對仔豬無任何不良反應，理論上有著良好的臨床治療應用價值，但實際的臨床應用效果還有待進一步驗證。

參考文獻：

［１］韓茹，谷艷秋． 我國豬瘟的預防與控制［Ｊ］． 畜牧獸醫科技信息，２００８（１）：４－５．

［２］金俊杰，董信田，肖劍，等． 自家高免血清防治ＰＭＷＳ效果試驗［Ｊ］． 上海畜牧獸醫通訊，２００８，７４（６）：４－５．

［３］孫協軍，王東亮，張強． 兔抗雞新城疫高免血清的制備與檢測［Ｊ］． 畜牧與飼料科學，２００６（３）：４２－４３．

［4］梁望旺，徐滌平，劉澤文，等．高致病性藍耳病與豬瘟混合感染的診斷［Ｊ］． 甘肅畜牧獸醫，２００７（６）：２７－２８．

［5］劉成文，張利亞，孫華安． 豬瘟與藍耳病混合感染的診治［Ｊ］．養殖與飼料，２００７（６）：４９．

［6］蘇銀來，蔡小云． 應用ＴＧＥ、ＰＥＤ二聯滅活疫苗與二聯高免血清緊急預防ＴＧＥ、ＰＥＤ［Ｊ］． 福建畜牧獸醫，２００１（４）：２０－２１．

［７］蘇彥安，曾祥偉，趙鑫，等． 貉抗犬瘟熱病毒高免血清的制備［Ｊ］． 東北林業大學學報，２０１０，３８（２）：１０９－１１０．