豬胃腸道微生物菌群的研究現(xiàn)狀淺析

摘要：動物胃腸道微生物菌群與宿主胃腸道環(huán)境和宿主所處的外界環(huán)境密切相關(guān)，形成統(tǒng)一的整體。本文對豬胃腸道微生物菌群的組成和分布、菌群的作用、影響菌群的因素以及菌群的研究手段和調(diào)控等進行了淺析，為豬胃腸道微生態(tài)區(qū)系的研究和調(diào)控提供參考。

關(guān)鍵詞：豬；胃腸道微生物菌群

中國分類號：S828.1－1 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942(2011)10—0090—05

動物胃腸道正常微生物區(qū)系在動物營養(yǎng)、健康、防病、免疫等方面發(fā)揮著重要作用。從19世紀法國微生物學(xué)家巴斯德提出正常菌群對宿主是有益的學(xué)說以來，人們對畜禽胃腸道正常微生物群的組成、定殖規(guī)律及其與宿主關(guān)系有了越來越多的了解。畜禽胃腸道微生物在正常情況下，各種菌群處于穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，保證其胃腸道正常的消化和吸收。同時，有益菌群定殖于胃腸道內(nèi)壁黏膜，形成非特異性生物保護屏障，抑制病原菌在消化道壁的定殖，維持胃腸道正常的微生態(tài)平衡。當外界環(huán)境發(fā)生變化或餌料變更等應(yīng)急狀態(tài)時，這種理想的微生物區(qū)系平衡會受到?jīng)_擊，消化道內(nèi)的有害菌群增多，將會導(dǎo)致細菌性疾病的暴發(fā)。由此可見，動物胃腸道微生物區(qū)系的理論平衡是宿主動物保持良好的健康狀況和發(fā)揮正常生產(chǎn)性能所必須的條件。因此，如何利用益生素、化學(xué)益生素等調(diào)控動物胃腸道微生物組成，保持動物胃腸道微生物區(qū)系平衡、維持動物健康成為國際上的研究熱點。

1 豬胃腸道微生物的組成和分布

研究表明，動物出生前胃腸道中是無菌的，但是出生后3-4 h，腸道內(nèi)開始檢測出細菌。微生物菌群在消化道內(nèi)的定殖順序首先是需氧菌，然后是兼性厭氧菌，最后是專性厭氧菌。蘇勇等(2006)研究結(jié)果顯示，哺乳期仔豬胃中細菌數(shù)量較低，Pluske等(2003)認為，哺乳期仔豬胃和小腸中的優(yōu)勢菌群為乳酸桿菌和鏈球菌。斷奶仔豬胃腸道微生物環(huán)境很不穩(wěn)定，斷奶應(yīng)急和日糧成分的變化，使胃腸道內(nèi)環(huán)境發(fā)生了改變，因而胃腸道中微生物的數(shù)量及定殖位點也會隨著發(fā)生改變。有研究顯示，無菌采集斷奶仔豬(30日齡)胃、十二指腸、回腸、盲腸和直腸各腸段及內(nèi)容物測定菌群數(shù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃、十二指腸、回腸、盲腸和直腸中雙歧桿菌(Bifidobacterium)均為優(yōu)勢菌，胃中雙歧桿菌最多，其次是乳酸桿菌。十二指腸中雙歧桿菌最多，其次是腸桿菌(Enter-obacter)、乳酸桿菌(LactobaciIlus)。回腸中雙歧桿菌最多，其次是腸球菌(Enterococcus)、小梭菌(Clostridium)、腸桿菌；盲腸中雙歧桿菌最多，其次是小梭菌；直腸中雙歧桿菌最多，其次是小梭菌、乳酸桿菌。而數(shù)量上，雙歧桿菌在十二指腸中最多，乳酸桿菌在胃、直腸中最多，腸桿菌在回腸中最多，腸球菌在回腸、直腸中最多，小梭菌在盲腸中最多。

2 豬胃腸道微生物菌群的作用

2.1 營養(yǎng)作用

動物胃腸道菌群依賴動物體自身營養(yǎng)或分解動物胃腸道內(nèi)食物而賴以生存，同時，菌群及其代謝過程產(chǎn)生的維生素及胞外酶產(chǎn)物可被動物機體吸收，在營養(yǎng)、消化和吸收方面具有重要作用。研究表明，非反芻動物以豬為例，胃腸道菌群在體內(nèi)能合成B族維生素并為宿主所利用；單胃動物盲腸中菌群可以產(chǎn)生有機酸，為動物機體提供營養(yǎng)的同時，還間接提高了蛋白質(zhì)和能量利用率，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸能抑制植酸對腸道中鈣和磷的絡(luò)合，增加機體對鈣和磷的吸收。

2.2 拮抗作用

定殖在豬胃腸道內(nèi)的細菌可以抑制外源菌生長與定殖，對豬健康生長、預(yù)防病害有積極意義。專性厭氧菌在代謝過程產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和乳酸，降低胃腸道pH和氧化還原電勢，從而抑制外源菌的生長和繁殖，同時大量酸使腸內(nèi)容物變酸，促進腸蠕動，從而使外源菌未與胃腸道黏膜表面接觸、粘附就被排出；另外占優(yōu)勢的腸道菌還通過與黏膜上皮細胞緊密結(jié)合，起到對宿主細胞占位性保護作用。此外微生物代謝產(chǎn)生一些抗菌的活性物質(zhì)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)能分泌具有廣譜抗菌活性的類細菌素物質(zhì)，對大腸桿菌(Escherichia coil)等革蘭氏陰性菌具有抑制作用。

2.3 免疫作用

胃腸道菌群與宿主之間是相互影響、相互作用的復(fù)雜系統(tǒng)。宿主將這些細菌當作自身免疫的一部分，一般不引起或僅產(chǎn)生低水平的免疫反應(yīng)。無菌動物的研究中，當腸道菌群缺乏時，往往造成腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育不良，腸道的形態(tài)也受到破壞，免疫球蛋白水平處于較低水平。研究認為，動物胃腸道穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)能協(xié)助動物免受感染，特別是胃腸道感染。乳酸菌在胃腸道中定殖可以抵抗致病菌、增強抗感染能力的同時，還可以增加腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)活性。

2.4 致病作用

動物胃腸道菌群正常條件下，處于動態(tài)平衡，維持動物胃腸道正常的生理功能，但當胃腸道內(nèi)外環(huán)境變化時，胃腸道的平衡遭到破壞，使病原菌或條件致病菌異常增殖，導(dǎo)致動物疾病的發(fā)生。

3 影響動物胃腸道菌群的因素

3.1 生長階段

仔豬胚胎處于無菌狀態(tài)，出生3-4 h后腸道內(nèi)可檢測到大腸桿菌和鏈球菌。仔豬從出生到斷奶后胃腸道菌群的組成一直在發(fā)生連續(xù)的變化，一般認為直到育肥期才趨于平衡。仔豬前兩周內(nèi)胃腸道微生物主要來源于母豬。斷奶后仔豬，由于斷奶應(yīng)激降低了自身循環(huán)抗體水平并抑制細胞免疫力和免疫水平，使仔豬抗病力弱易感染病原微生物。另一方面，斷奶后消化酶活力下降，消化和吸收能力下降，使未消化的營養(yǎng)物質(zhì)被病原菌利用而大量增殖，從而使仔豬消化道微生物區(qū)系發(fā)生紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后營養(yǎng)供應(yīng)由母乳轉(zhuǎn)向飼料，胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)由乳酸菌為主的多樣性程度較低的簡單區(qū)系到以厚壁菌門和擬桿菌門細菌為主的高度多樣化的復(fù)雜區(qū)系的重建過程。

3.2 環(huán)境因素

外界環(huán)境如氣溫劇變會引起豬胃腸道菌群的數(shù)量變化。應(yīng)激能破壞已建立的腸道保護性微生物群系。應(yīng)急條件下，腸道微生物區(qū)系中乳酸菌減少，大腸桿菌數(shù)量增加，使腸腔積水，上皮細胞破壞，甚至導(dǎo)致腹瀉。

3.3 日糧

日糧發(fā)生變化時，動物胃腸道菌群也出現(xiàn)相應(yīng)改變。日糧中的營養(yǎng)成分可以選擇性地刺激特定細菌生長。改變?nèi)占Z中纖維數(shù)量可以調(diào)控胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。高纖維日糧顯著增加動物胃腸道中纖維分解菌數(shù)目。日糧類型對豬胃腸道微生物區(qū)系也有影響。飼喂液態(tài)飼料與飼喂干態(tài)日糧相比，豬胃腸道內(nèi)容物大腸桿菌顯著降低，乳酸桿菌升高，但差異不顯著。可能因為液體飼料發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸，使胃腸道pH值低于5.8，從而明顯抑制了大腸桿菌的生長，使乳酸桿菌與大腸桿菌的比值幅度增大。另外，許多非營養(yǎng)添加劑，如抗生素、益生素和中草藥等，都會影響胃腸道微生物區(qū)系。

3.4 豬的生理狀態(tài)

動物處于不同生理狀態(tài)，其胃腸道菌群數(shù)量和種類也呈現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)特征。研究發(fā)現(xiàn)，健康仔豬糞便中存在大腸桿菌但不表現(xiàn)為優(yōu)勢菌，而腹瀉仔豬糞便中，大腸桿菌為優(yōu)勢菌，顯示仔豬腹瀉與大腸桿菌的過度繁殖成為腸道優(yōu)勢菌有很大關(guān)系。

4 胃腸道菌群的研究手段

生態(tài)系統(tǒng)是由宿主、微生物和環(huán)境之間相互作用構(gòu)成的統(tǒng)一整體，由各個層次、環(huán)節(jié)相互結(jié)成的立體交叉網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)就是微生態(tài)系統(tǒng)的多維空間結(jié)構(gòu)。

動物胃腸道微生物菌群與動物胃腸道環(huán)境和動物所處的外界環(huán)境密切相關(guān)，形成一個有機整體。動物胃腸道菌群與動物生長健康之間有密切的關(guān)系，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究胃腸道菌群的手段不斷創(chuàng)新。目前，研究手段主要為常規(guī)的分離培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)方法。

4.1 常規(guī)分離培養(yǎng)技術(shù)

常規(guī)分離培養(yǎng)技術(shù)是將樣品直接接種于不同種類的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中，通過生物化學(xué)方法將分離純化到的不同微生物進行分類學(xué)鑒定和數(shù)量分析。分離培養(yǎng)技術(shù)是研究動物胃腸道微生態(tài)不可或缺的方法，通過分離培養(yǎng)技術(shù)可以獲得純培養(yǎng)物，并對微生物的組成、數(shù)量及其特性進行研究，獲得比較全面的信息，為理論研究和生產(chǎn)實踐提供重要的依據(jù)。

然而該方法同時也存在局限性，環(huán)境微生物很多是不可培養(yǎng)的，大多數(shù)厭氧微生物未被鑒定和描述，而且常規(guī)分離培養(yǎng)技術(shù)操作過程繁冗。其缺陷概括為以下幾個方面：(1)大部分微生物不能通過人工培養(yǎng)，可培養(yǎng)的細菌中也近有20％無法定性分析；(2)體外培養(yǎng)的微生物與其在自然狀態(tài)下的形態(tài)和特征存在差異；(3)分離培養(yǎng)技術(shù)操作過程繁冗。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法鑒定細菌生長至少要12-24 h，而一些細菌生長較慢，營養(yǎng)要求高，鑒定所需時間更長。純化需要時間更長，至少需要3 d，多則15 d以上。細菌生化鑒定過程，生化試劑較多，鑒定后對比工作較為繁雜，而且鑒定結(jié)果與人的主觀因素有很大關(guān)系。

因此，常規(guī)分離培養(yǎng)方法無法獲取消化道菌群的全面信息，必須結(jié)合其他有效的方法更加全面的深入研究。

4.2 分子生物學(xué)方法

微生態(tài)區(qū)系的研究及其群落多樣性分析是微生物生態(tài)學(xué)研究內(nèi)容，能準確、方便、快速地鑒定環(huán)境中的微生物個體，并對復(fù)雜群落結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律進行評價和分析。現(xiàn)今較成熟的技術(shù)有遺傳指紋、基因序列分析、全細胞原位雜交和定時定量PCR技術(shù)等。

4.2.1 16S rRNA技術(shù)在生物進化過程中，生物的核糖體RNA保持恒定的生物學(xué)功能和保守的堿基排列順序，與進化過程突變頻率一致，在結(jié)構(gòu)上分為保守區(qū)和可變區(qū)。而原核生物核糖體小亞基的16S rRNA片段長度和堿基排列復(fù)雜程度適中，序列分析比較起來較為容易，利用通用引物對保守區(qū)部分或全部16S rDNA序列PCR擴增，通過對可變區(qū)設(shè)計特異性引物或探針進行屬、種和株系的區(qū)分。

4.2.2 核酸分子雜交技術(shù)該技術(shù)是利用DNA分子堿基互補配對原理，用特異性的核酸探針與待測樣品的DNA或RNA進行雜交，從而來檢測特定微生物類群的數(shù)量和組成。微生物的檢測范圍是由探針的特異性來決定的，例如用專一性探針對某一類微生物進行雜交，便可檢測出該類群微生物的存在。目前常用的核酸分子雜交技術(shù)主要是斑點雜交、熒光原位雜交技術(shù)和基因芯片技術(shù)。

4.2.3 實時熒光定量PCR技術(shù)該技術(shù)是指將熒光集團加入到PCR反映體系，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，結(jié)合標準曲線對未知模板進行分析的方法。該方法測定的并非是PCR產(chǎn)物，而是由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)(Ct值)，Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)呈反比，能準確定量并反映出真實情況。該技術(shù)與其它分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，可以定性、定量的研究微生物區(qū)系的變化，深入了解微生物菌群與環(huán)境之間的相互作用及其動態(tài)變化過程，為全面、快速、準確分析鑒定復(fù)雜環(huán)境中微生物菌群提供了一種新的技術(shù)手段。

4.2.4 遺傳指紋技術(shù)該技術(shù)被引入到微生態(tài)研究中，逐步克服傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的不足。其中變形梯度凝膠電泳(denatufing gradient gel elec—trophoresis，DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(tern-perature gradient gel electrophoresis，TGGE)技術(shù)是直接利用DNA或RNA對微生物遺傳多樣性進行分析，可以鑒定出傳統(tǒng)方法不能分離到的細菌。該方法能方便、快捷地鑒定環(huán)境中微生物個體，并能進行復(fù)雜微生物演替規(guī)律、種群動態(tài)性、基因定位、表達和調(diào)控的評價分析。

細菌16S rDNA中有多個片段高度保守，該區(qū)域可變區(qū)的差異，可以設(shè)計細菌通用引物，來擴增細菌16S rDNA片段，區(qū)分不同的菌種。16SrDNA是菌群結(jié)構(gòu)分析常用的分子標記技術(shù)。

PCR／DGGE技術(shù)廣泛用于土壤、人類、豬胃腸道、海面、蝦及魚類等菌群結(jié)構(gòu)的研究中，該技術(shù)包括樣品細菌總DNA的提取、引物及探針的設(shè)計、PCR擴增、梯度凝膠電泳、基因文庫的篩選、序列測定和序列分析等。

5 豬胃腸道微生物的調(diào)控

豬消化道正常菌群的建立對于消化系統(tǒng)的正常發(fā)育具有重要的作用，而且正常菌群的建立能夠作為生物屏障阻止致病菌的入侵，同時提高豬的免疫力。因此，加強豬胃腸道微生物菌群的研究，在此基礎(chǔ)上開發(fā)出綠色高效的益生素和化學(xué)益生素等調(diào)控豬胃腸道微生物菌群，保持胃腸道微生物區(qū)的穩(wěn)定，有望提高豬的抗病力和生產(chǎn)性能。

5.1 益生素

益生素(Probiotics)是一類通過促進腸道微生物平衡對宿主動物產(chǎn)生有益影響的活的微生物飼料添加劑，最早應(yīng)用于陸生動物。益生素通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，如產(chǎn)生細菌素、類細菌素達到抑菌作用；益生素粘附在胃腸道菌(Lactococcus lactis)膜上皮細胞，形成保護性生物膜，有效減少病原菌的定位轉(zhuǎn)移、日糧和黏膜抗原經(jīng)腸道的轉(zhuǎn)移，避免局部炎癥或者是自身免疫感染性疾病的發(fā)生，從而促進腸道的修復(fù)；另外，益生素有提高機體免疫機能、促進機體營養(yǎng)吸收等作用。研究表明，乳酸菌、芽孢桿菌(Bacillus)、酵母菌等均可作為益生素調(diào)控胃腸道微生物的組成。

益生素產(chǎn)品在調(diào)控仔豬腹瀉疾病中效果較好，但到目前為止，對益生素的研究絕大多數(shù)還在使用效果上，對其作用機理研究還不夠。專門化和序列化菌種的研制生產(chǎn)，研究益生素對胃腸道菌群的定性、定量和定位的作用機理，對針對性更好的菌種的尋找十分有益。總之，益生素作為一種天然綠色飼料添加劑，沒有抗生素的副作用，今后在畜牧業(yè)上的應(yīng)用將更加廣泛。

5.2 益生元

益生元(Prebiofics)，狹義來講益生元主要是寡糖類產(chǎn)品，如果寡糖(FOS)、甘露寡糖(MOS)、異麥芽寡糖(a—GOS或IMO)等。MOS是從啤酒酵母中分離得到，不能被病原菌利用，但卻可以激活有益菌，促進腸道菌群向更加有益的細菌和類型轉(zhuǎn)變。日糧中添加MOS能顯著改善仔豬生產(chǎn)性能，對仔豬免疫機能也有一定影。FOS是一種非消化性寡糖，在小腸中有選擇性吸收能力，可以破壞有害微生物，增加小腸有益菌密度，對揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生也有一定效果。總之，益生元作為飼料添加劑能調(diào)節(jié)豬消化道微生物組成，提高豬抗病力和生產(chǎn)性能，但益生元對豬胃腸道微生物菌群的調(diào)控機制尚需進一步研究。

5.3 酸化劑(Acidic Agents)

畜禽胃腸道內(nèi)乳酸菌等有益菌適宜在酸性環(huán)境中繁殖，致病菌生長的適宜pH值大多呈中性或偏堿性，因此酸化劑主要是通過降低胃腸道pH值，從而抑制有害微生物繁殖，減少營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和抗生長毒素的產(chǎn)生，同時促進有益菌的增殖。目前，生產(chǎn)中常用酸化劑主要包括單一酸化劑、以磷酸為基礎(chǔ)的復(fù)合酸化劑和以乳酸為基礎(chǔ)的復(fù)合酸化劑3種。單一酸化劑中延胡索酸和檸檬酸效果佳；復(fù)合酸化劑中以乳酸為基礎(chǔ)的復(fù)合酸顯著優(yōu)于以磷酸為基礎(chǔ)的復(fù)合酸。

5.4 其它

日糧、飼喂方式等日常管理上進行胃腸道微生物調(diào)控，也可以有效維持動物胃腸道微生態(tài)平衡，從而提高豬的生長性能，降低豬發(fā)病率，從根本上提高養(yǎng)豬經(jīng)濟效益。

6 展望

雖然豬胃腸道微生態(tài)的研究成為當前一個前沿領(lǐng)域，關(guān)于胃腸道微生態(tài)區(qū)系及其調(diào)控的研究還較薄弱。這也間接導(dǎo)致了生產(chǎn)中益生素和化學(xué)益生素的使用效果不穩(wěn)定，限制了在豬禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用。因此加強豬胃腸道微生物組成和結(jié)構(gòu)的研究，指導(dǎo)高效益生素、化學(xué)益生素和中草藥的開發(fā)和應(yīng)用，促進我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的同時，還有助于從根本上解決養(yǎng)殖行業(yè)中抗生素和其他化學(xué)藥物的長期大量使用所帶來的負面效應(yīng)，具有重要而深遠的意義。

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