傳染性單核細胞增多癥患兒外周血EBV-DNA載量與T細胞亞群的相關性分析

[摘要] 目的 應用流式細胞術檢測傳染性單核細胞增多癥（IM）患者與正常兒童T細胞亞群、Treg細胞的百分比；分析IM患者急性期外周血EB病毒DNA濃度與它們的相關性。方法 選取確診為兒童傳單且外周血EBV-DNA陽性的急性期患者47例，同期正常兒童32例作為對照，比較兩組患者外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127-的變化，分析它們與EBV濃度的相關性。結果 IM組患者與對照組相比急性期CD3+、CD8+ T細胞百分比明顯上升，CD4+、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127-下降。在急性期IM患者組病毒載量與CD3+、CD8+ T細胞均呈正相關；與CD4+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127-細胞呈負相關。結論 傳染性單核細胞增多癥患者急性期存在細胞免疫及免疫調節功能紊亂，其免疫功能紊亂的程度與EB病毒感染量有關，為臨床IM患兒的治療提供了理論依據。調節性T細胞在IM患兒急性期減少，可能在IM的發病機制中起了重要的作用。

[關鍵詞] 傳染性單核細胞增多癥；T淋巴細胞亞群；流式細胞儀；EB病毒DNA；CD4+CD25+CD127-

[中圖分類號] R725.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）34-01-02

Correlated Analysis of Epstein-Barr Virus Load and Changes of T Cell Subsets in Children with Infectious Mononucleosis

GUO Juanjuan1 CHANG Hong2 HAO Guoping2 WANG Xiaohuan2 ZHU Lei3

1.Shanxi Medical Univercity，Taiyuan 030001，China；2.Department of Hematology，the Children's Hospital in Shanxi Province，Taiyuan 030000，China；3.Department of Laboratory，the Children's Hospital in Shanxi Province，Taiyuan 030000，China

[Abstract] Objective To measure the expression level of T lymphocyte subsets in children with infectious mononucleosis（IM） during acute phase；To study the correlation of Epstein-Barr Virus load and changes of T cell subsets in children with IM. Methods T lymphocyte subsets and regulation T cells in peripheral blood were measured by flow cytometry in 47 cases with acute infectious mononucleosis. The measured results were compared with that of 32 normal children. Results Compared with the following results in controls，CD3+，CD3+CD8+ were increased and CD3+CD4+，CD4+/CD8+ ratio，CD4+CD25+，CD4+CD25+CD127- were reduced in the IM patients at the acute stage. There was a positive correlation between EBV loaf and CD3+，CD8+ during acute phase. There was a negative correlation between EBV load and CD4+ and CD4+/CD8+ratio，regulation T cells during acute phase. Conclusion There lies the immune dysfunctions in the children with acute infectious mononucleosis. The degree of immune dysfunction is relevant to EBV-DNA copy number. Meanwhile，regulation T cells of peripheral blood in the IM patients was diminished，they possible play an important role in the pathogenesis of IM.

[Key words] Infectious mononucleosis；T lymphocyte subsets；Flow cytometry；EBV-DNA；CD4+CD25+CD127-

傳染性單核細胞增多癥（IM），是一種由EB病毒感染引起的急性或亞急性全身性疾病[1]，是兒科常見的一種病毒性疾病，臨床癥狀復雜、多樣[2]，臨床多表現為發熱、咽炎和頸淋巴結腫大、肝脾腫大、外周血中會出現異型淋巴細胞等。此病早期癥狀不典型，診斷較困難，易漏診或誤診，且往往有多臟器損害情況。因此兒科大夫診斷是非常重要的。臨床上通常根據癥狀及檢測EB病毒抗體來確定，近年來關于EB病毒DNA檢測在臨床上受到重視，有研究表明，EB病毒DNA檢測較抗體檢測陽性率更高[3]。同時隨著免疫學的深入研究，EB病毒對機體免疫功能的影響受到了廣大學者的關注，現代研究認為IM患者多有免疫調節功能紊亂，尤其是T細胞免疫功能紊亂。本文旨在通過檢測IM患者急性期細胞免疫變化情況及探討IM患者EB病毒濃度與T細胞亞群及Treg細胞之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

IM患者47例（觀察組）均為2010年8月～2011年8月山西省兒童醫院收治住院患兒，EBV-DNA均為陽性，診斷以《實用兒科學》第7版中的診斷IM依據，根據臨床表現、周圍血象和血清血檢查確診[4]。IM組共47例，男22例，女25例，年齡1～12歲，平均4.8歲；對照組為同期兒童保健門診的正常兒童32例，男21例，女11例，年齡3～12歲。平均5歲，兩組兒童性別、年齡的差異均無統計學意義（P＞0.05）。所有患兒既往無免疫低下及過敏性疾病史和過敏性疾病家族史。

1.2 試劑、儀器

T細胞亞群及Treg細胞測定：Optilyse lysing solution（溶血素） CD4-PC5、CD25-FITC、CD127-PE單克隆抗體CD4-FITC/CD8- FE/CD3-PC5三標記單克隆抗體購買于美國貝克曼庫爾特有限公司，FC500型流式細胞儀購于美國Coulter公司。

EBV濃度：EB病毒核酸擴增熒光檢測試劑盒購買于中山大學達安基因股份有限公司。美國的ABI-7300實時FQ-PCR儀。

1.3 檢測方法

流式細胞術定量檢測IM患兒急性期外周血Treg細胞及T細胞亞群，以%表示。取清晨患兒及健康者空腹外周靜脈血1mL，EDTA試劑抗凝。每個患者取兩個試管，于一支試管中加入5μL三標記單克隆抗體，一支加入5μL的CD4-PC5、CD25-FITC、CD127-PE單克隆抗體，再分別加入20μL抗凝靜脈血，充分混勻，室溫避光，孵育20min后，加入紅細胞裂解液（溶血素）100μL，以1000r/min的速度離心5min，棄上清，生理鹽水洗滌1次，最后以500μL的生理鹽水懸浮細胞。流式細胞儀檢測10 000個淋巴細胞。

EBV-DNA載量檢測：采集清晨空腹外周靜脈血2mL采用ABI-7300 FQ-PCR儀（實時熒光定量PCR）進行檢測，檢測步驟、結果判斷以及質量控制方法按其公司試劑操作說明進行。檢測極限為5×102copies/μL，大于或等于該值為陽性。

1.4 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件，檢測結果求出均數±標準差，組間比較采用t檢驗。EBV-DNA含量與T亞群及Treg細胞相關性分析采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 IM組與對照組T亞群及Treg細胞水平比較

與正常對照組相比，急性期IM患兒，CD3+、CD8+明顯高于對照組（P均＜0.01），CD4+、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+、CD4+CD25+ CD127-與正常組比較都明顯下降，差異有統計學意義（P均＜0.01），結果見表1。

2.2 IM組急性期EBV-DNA濃度與T細胞亞群及Treg細胞之間的相關性分析

相關性結果（表2）表明，在急性期EB病毒載量與CD3+、CD8+ T細胞均呈正相關；與CD4+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+、CD4+ CD25+CD127-細胞呈負相關。

3 討論

EB病毒被國際癌癥研究機構歸為Ⅰ類致癌物質。是一種嗜淋巴細胞的DNA病毒，屬皰疹病毒屬，具有潛伏和轉化的特性[5]。感染后多數表現為傳染性單核細胞增多癥，部分患兒因病情得不到控制，感染可遷延不愈或繼發其它惡性疾病[6]，如慢性活動性EB病毒感染、EBV相關的噬血細胞綜合征、急性淋巴細胞白血病、T/NK細胞淋巴增生性疾病、淋巴瘤、移植后淋巴細胞增生性疾病等。傳單是這種病毒感染最常見的。

近年來IM發病率有逐年上升趨勢，而且對此病的研究也越來越多，研究發現[7]IM的發病過程中存在細胞免疫異常情況。其發病機制是EBV感染并在細胞內進行復制，細胞溶解后病毒釋放入血液，再感染B淋巴細胞，由于體內B細胞具有EB病毒受體，故B細胞先受累，繼而引起T細胞和NK細胞產生大量的細胞因子，活化的B細胞刺激CD8+細胞增殖活化，發展到一定程度的B細胞可與CD8+細胞相互結合而出現凋亡，使淋巴細胞增殖呈自限性變化。所以在限制EB病毒感染的B細胞增殖過程中，CD8+ T細胞起重要作用，而CD4+細胞能促進B、T細胞和其它免疫細胞的增殖和分化，能有效清除EB病毒。因此認為細胞免疫對EBV感染起決定性作用，CD4+/CD8+比值是重要的免疫狀態的檢測指標，其比例的降低與免疫系統損傷的程度相關[8]。本實驗中已經證實IM組患者與對照組相比急性期CD3+、CD8+ T細胞百分比明顯上升，提示患兒EB病毒感染后導致機體T細胞發生強烈反應。CD4+、CD4+/CD8+明顯下降，顯示細胞免疫功能下降。此結果與許多相關研究相一致。

曹曉軍等研究提示IM患兒存在免疫調節功能紊亂，致使抗病毒的功能降低，是導致IM患兒病情加重或惡化的重要原因[9]。調節性T細胞是一群具有免疫抑制功能的細胞，其能抑制效應T細胞的過度活化，對維持機體免疫自穩、防止自身免疫發生具有極其重要的作用。近年來有文獻報道了Treg細胞的新標志物CD4+CD25+CD127-。同時不少研究表明，此細胞與許多疾病的發病機制相關。國內外關于EB病毒感染者的外周血CD4+CD25+ CD127-的報道很少，為此，以IM為例，本文實驗結果顯示CD4+ CD25+CD127-細胞在IM患兒外周血中比例明顯降低，這表明它可能參與了IM疾病的發病過程。同時還可以看到調節性T細胞與EB病毒濃度呈負相關，可見患兒機體感染EB病毒，Treg細胞在殺傷病毒、維持內環境的穩定中可能發揮了不可忽視的作用。

綜上所述，從本實驗中結果顯示，EBV-DNA濃度與T細胞亞群及調節性T細胞存在相關性，調節性T細胞在EBV感染兒童IM發病過程中，數量減少，提示可能發揮了主要的作用。臨床上在使用抗病毒的同時，加用免疫治療，對疾病的預后和病情評估有幫助。外周血EBV-DNA濃度對傳染性單核細胞增多癥的診斷價值極高，濃度越高，免疫功能紊亂越重，提示含量與IM的病程密切相關。此兩項可以作為判斷療效及檢測病情的指標。此實驗選擇樣本為小樣本，需要進一步驗證。

[參考文獻]

[1] 胡亞美，江載芳. 諸福棠實用兒科學[M]. 第7版. 北京：人民衛生出版社，2002：819-827.

[2] 朱易萍，高舉，杜惠容，等. 196例傳染性單核細胞增多癥并發癥和實驗室檢查[J]. 實用兒科臨床雜志，2003，18（11）：902.

[3] 蘇犁云，徐錦，孫家娥，等. EB病毒感染實驗室診斷方法探討[J]. 檢驗醫學，2006，21（5）：513-516.

[4] 陸華，諸美瞻，胡亞美. 傳染性單核細胞增多癥[M]. //胡亞美，江載芳.諸福棠實用兒科學. 第7版. 北京：人民衛生出版社，2002：821-825.

[5] 羅曉明，周馥英，周永列，等. 傳染性單核細胞增多癥B淋巴細胞及其活化狀態的研究[J]. 中華兒科雜志，2004，42（9）：701-704.

[6] 郭龍. EB病毒與非腫瘤性重癥疾病[J]. 中國實用兒科雜志，2008，23（1）：64-66.

[7] Scherrenburg J，Pirious ER，Nanlohy NM，et al. Detailed analysis of Epstein-Barr virus-specific CD4+ and CD8+ T cell responses during infectious mononucleosis[J]. Clin Exp Immunol，2008，153（2）：231-239.

[8] Yasutomo K. The cellular and molecular mechanism of CD4+/CD8+ lineage commitment[J]. Med Invest，2002，49（1/2）：1.

[9] 曹曉軍，倪慧萍. 傳染性單核細胞增多癥患兒T細胞亞群變化及臨床意義[J]. 江蘇大學學報，2007，17（5）：429-431.

（收稿日期：2011-09-27）