肝膽管結石上皮Survivin及PCNA表達與肝膽管癌關系的研究

[摘要] 目的 探討肝膽管結石上皮Survivin及增殖細胞核抗原（PCNA）表達與肝膽管癌之間的關系。方法 采集正常對照、肝膽管結石、肝膽管癌患者肝膽管組織，免疫組化法測定肝膽管上皮Survivin及PCNA表達陽性率。結果 正常對照、肝膽管結石、肝膽管癌患者肝膽管上皮Survivin表達陽性率分別為0、42.1%和70.0%。三組間兩兩比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。正常對照組PCNA陽性率為0，而肝膽管結石、肝膽管癌患者肝膽管上皮PCNA表達陽性率均為100%，強度為++或+++。其中肝膽管結石組的PCNA與病程長短和結石大小呈正相關，肝膽管癌組的Survivin和PCNA表達呈正相關（r＝0.701，P＜0.01）。結論 肝膽管結石上皮組織高表達Survivin及PCNA，提示肝膽管結石上皮有癌變傾向。

[關鍵詞] Survivin；PCNA；肝膽管結石；肝膽管癌

[中圖分類號] R735.8；R657.4 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）23-53-03

The Correlation between the Expression of Survivin and PCNA in Hepatobiliary Epithelium of Hepatolithiasis and Cholangiocarcinoma

ZHANG Miaozun1 LI Mingzhu1 GU Xin2

1.Department of Hepatobiliary Surgery， the People’s Hospital of Yinzhou， Ningbo 315040， China; 2.Department of Pathology， the People’s Hospital of Yinzhou， Ningbo 315040， China

[Abstract] Objective To estimate the correlation between the expression of survivin or PCNA in hepatobiliary epithelium of hepatolithiasis and cholangiocarcinoma. Methods The specimens of hepatobiliary tissue from the paitents of normal control， hepatolithiasis and cholangiocarcinoma were obtained during the surgeries. The expressions of survivin or PCNA were examined by immunohistochemistry. Results The positive expression rates of survivin were 0， 42.1% and 70.0% in control group， hepatolithiasis group and cholangiocarcinoma group respectively. The hepatolithiasis and cholangiocarcinoma groups had statistically higher rates of survivin than that of control group （P＜0.05）. And the rates in cholangiocarcinoma patients were significantly increased， compared to that in hepatolithiasis （P＜0.05）. Hepatobiliary tissue didn’t have PCNA expression in control group. However， the positive PCNA rates in hepatolithiasis and cholangiocarcinoma were both 100% with levels from ++ to +++. PCNA rates in hepatolithiasis were significantly associated with duration and diameter of calculus. A positive correlation was found between survivin and PCNA in cholangiocarcinoma group （r＝0.701，P＜0.01）. Conclusion Increasing expression of survivin and PCNA in hepatolithiasis indicates that the epithelium of hepatolithiasis has a high risk of developing cholangiocarcinoma.

[Key words] Survivin; PCNA; Hepatolithiasis; Cholangiocarcinoma

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）的成員，表達于細胞分裂期，具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的作用，在癌癥的發生及發展過程中起著重要的作用，是很多癌癥的重要生物標志物之一。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是反映細胞增殖活性的重要指標，PCNA表達越多，則提示腫瘤細胞增殖越快。肝膽管癌生長緩慢隱蔽，臨床上很難早期發現，往往以梗阻性黃疸為首發癥狀，術后復發性高，預后差。病理檢查發現，肝膽管癌中心經常合并有結石的發生，因此我們推測，肝膽管癌的發病機制之一可能是肝膽管結石上皮的惡變與發展。本次研究通過對正常對照、肝膽管結石、肝膽管癌患者的肝膽管上皮細胞中Survivin及PCNA表達的研究，探討Survivin及PCNA表達與肝膽管癌的關系，以期進行早期預測肝膽管結石患者肝膽管上皮癌變的可能性。

1 材料與方法

1.1 標本

所有標本取自本院2001年1月～2009年6月術后存檔石蠟塊。其中外傷性患者肝膽管上皮組織8例作為正常陰性對照，男6例，女2例，年齡24～57歲，平均41.2歲；肝膽管結石標本38例，男10例，女28例，年齡29～79歲，平均53.8歲，結石大小0.3～2.0cm，平均1.1cm，病程0.25～34年，平均10.7年；肝膽管癌標本20例，男13例，女7例，年齡43～67歲，平均55.3歲，臨床分期Ⅰ～Ⅲ期，病理分化級別中或高度分化，60%合并結石。所有石蠟塊標本進行4μm連續切片10張。

1.2 免疫組化染色

采用免疫組化S-P法，試劑盒[兔抗人Survivin或PCNA免疫組化多克隆抗體即用型、過氧化物酶標記的鏈霉卵白（SP）染色試劑盒，濃縮型二甲基聯苯胺（DAB）試劑]購自福州邁新生物技術開發有限公司。操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.3 Survivin及PCNA免疫組化染色陽性分級

每張切片隨機選10個高倍視野，每個視野計數100個細胞陽性細胞所占的百分比，分為4個等級：陽性細胞所占百分比＜5％為陰性（-）；陽性細胞所占百分比在6％～25％為弱陽性（+）；陽性細胞所占百分比在26％～50％為中等陽性（++）；陽性細胞所占百分比＞50％為強陽性（+++）[1]。

1.4 統計學方法

采用SPSS12.0進行數據的統計分析。陽性率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，陽性率與臨床特征關系的分析采用多元線性回歸分析。

2 結果

2.1 Survivin免疫組化染色結果

正常組的8例樣本中，未發現有Survivin陽性者。而肝膽管結石組和肝膽管癌組的陽性率分別為42.1%、70.0%（圖1，圖2），與正常組比較，陽性率升高明顯，差異有統計學意義（P＝0.029、0.001）。肝膽管癌組的陽性率高于肝膽管結石組，差異有統計學意義（P＝0.043），見表1。本次研究未發現肝膽管結石組Survivin表達陽性率與患者性別、年齡、病程長短、膽管是否擴張以及結石直徑等臨床特征有統計學顯著關系。

注：與正常組比較，*P＝0.029，**P＝0.001；與肝膽管結石組比較，#P＝0.043

2.2 PCNA免疫組化染色結果

本次研究未發現正常對照組肝膽管上皮有PCNA表達（陽性率為0），而肝膽管結石、肝膽管癌患者肝膽管上皮均表達PCNA（陽性率均為100%），強度為++或+++（圖3，圖4）。肝膽管結石組PCNA的表達與患者病程長短、結石直徑呈顯著正相關，相關系數r分別為0.024（P＜0.01）、0.370（P＜0.05）。

2.3 Survivin和PCNA關聯性

肝膽管癌組Survivin和PCNA表達呈正相關（r=0.701，P＜0.01），而結石組兩者間無相關關系（P＞0.05）。

3 討論

癌癥的發生、發展是一個多基因、多步驟、多階段的過程[2]。近年來研究表明，Survivin是一種敏感性較高的腫瘤標志物，表達于腫瘤細胞，而正常終末分化細胞沒有該蛋白的表達[3-5]。本次研究中，正常組織及肝膽管癌組織Survivin表達陽性率為0和70.0%，與國內外一些研究結果一致[6-8]。肝內膽管結石和肝膽管癌的發生密切相關，為絕大多數學者所共識，此次研究發現，肝膽結石組的陽性率接近50%，提示Survivin表達升高可能是肝膽管癌發生的早期事件，它可能在肝膽管癌的發生、發展中起到重要作用。近來，有學者提出用Survivin特異性siRNA來下調或阻斷高藥物抵抗性的A549/DDP癌細胞中高水平表達的Survivin[6]，MTT結果顯示，癌細胞的IC50和藥物抵抗性顯著降低，提示Survivin基因敲除可以增加細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖以及提高腫瘤細胞對放療和化療的敏感度[9，10]。本研究和其他研究一樣[11-13]未發現Survivin表達與肝膽結石或肝膽管癌患者的臨床特征有關聯，可能與樣本數較少有關，有待增加樣本量進行進一步研究。

PCNA與細胞周期中S期增殖有關，對DNA復制起重要作用，它與腫瘤分化程度、組織學分級等有密切關系[14]，多種癌癥如肝癌、胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌等都有該蛋白的高表達[15-19]。本次研究中，所有肝膽管結石及肝膽管癌上皮PCNA表達均為陽性，陽性率為100%，表達強度為++～+++，提示本次研究中的肝膽管結石上皮有進一步惡變成肝膽管癌的高可能性。

總之，本次研究表明，肝膽管結石上皮組織高表達Survivin及PCNA，表明肝膽管結石上皮有癌變傾向，Survivin及PCNA等腫瘤相關蛋白表達的測定，可能成為預測慢性肝膽結石患者膽管上皮癌變風險的指標。

[參考文獻]

[1] Kawasaki H，Toyoda M，Shinohara H，et al. Expression of survivin correlates with apoptosis， proliferation， and angiogenesis during human colorectal tumorigenesis[J]. Cancer，2001，91（11）：2026-2032.

[2] Rakha EA，El-Sayed ME，Reis-Filho JS，et al. Expression profiling technology: its contribution to our understanding of breast cancer[J]. Histopathology，2008，52（1）：67-81.

[3] Tamm I，Wang Y，Sausville E，et al. IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas （CD95）， Bax， caspases， and anticancer drugs[J]. Cancer Res，1998，58（23）：5315-5320.

[4] Wang Z，Xie Y，Wang H. Changes in survivin messenger RNA level during chemotherapy treatment in ovarian cancer cells[J]. Cancer Biol Ther，2005，4（7）：716-719.

[5] Ikeguchi M，Liu J，Kaibara N. Expression of survivin mRNA and protein in gastric cancer cell line （MKN-45） during cisplatin treatment[J]. Apoptosis，2002，7（1）：23-29.

[6] Liu JL，Wang Y，Jiang J，et al. Inhibition of survivin expression and mechanisms of reversing drug-resistance of human lung adenocarcinoma cells by siRNA[J]. Chin Med J （Engl），2010，123（20）：2901-2907.

[7] Tanabe H，Yagihashi A，Tsuji N，et al. Expression of survivin mRNA and livin mRNA in non-small-cell lung cancer[J]. Lung Cancer，2004，46（3）：299-304.

[8] 康惠貞，李勝棉，趙玉斌. Survivin、Bcl-2和Bax在肝外膽管異型增生組織和癌組織中的表達及意義[J]. 現代中西醫結合雜志，2010，19（9）：1061-1064.

[9] Lu B，Mu Y，Cao C，et al. Survivin as a therapeutic target for radiation sensitization in lung cancer[J]. Cancer Res，2004，64（8）：2840-2845.

[10] Coma S，Noe V，Lavarino C，et al. Use of siRNAs and antisense oligonucleotides against survivin RNA to inhibit steps leading to tumor angiogenesis[J]. Oligonucleotides，2004，14（2）：100-113.

[11] Zhu XD，Lin GJ，Qian LP，et al. Expression of survivin in human gastric carcinoma and gastric carcinoma model of rats[J]. World J Gastroenterol，2003，9（7）：1435-1438.

[12] Tanaka K，Iwamoto S，Gon G，et al. Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas[J]. Clin Cancer Res，2000，6（1）：127-134.

[13] Sarela AI，Scott N，Ramsdale J，et al. Immunohistochemical detection of the anti-apoptosis protein， survivin， predicts survival after curative resection of stage Ⅱ colorectal carcinomas[J]. Ann Surg Oncol，2001，8（4）：305-310.

[14] 李明，閆豐，邰智慧，等. CerbB-2、P53及PCNA在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 山東醫藥，2010，50（24）：55-56.

[15] 徐春艷. 肝細胞癌分級與PCNA關系的臨床研究[J]. 中國醫藥指南，2008，6（16）：490-491.

[16] 劉坤，李庚，馮艷玲. 胃癌和癌前病變組織中端粒酶、PCNA的表達及意義[J]. 山東醫藥，2008，48（47）：4-5.

[17] 劉偉杰，秦環龍，張惠箴，等. 大腸癌中CerbB-2、P53、PCNA蛋白的表達及臨床意義[J]. 實用醫學雜志，2010，26（16）：2928-2930.

[18] 庹新蘭，白明. 肺癌組織中hMSH2及PCNA的表達及意義[J]. 中國現代醫學雜志，2005，15（5）：691-694.

[19] 楊昆憲，唐曉丹，遲昆萍. 同一乳腺癌患者新輔助化療前后ER/PR、MVD、Neu、PCNA及MDR的表達及其相關性研究[J]. 中國醫學創新，2009，6（17）：7-9.

（收稿日期：2011-04-25）