新城疫病毒(NDV)對卵巢癌細(xì)胞株(SKOV-3)的殺傷作用

[摘要] 目的 研究新城疫病毒（NDV）對卵巢癌細(xì)胞株（SKOV-3）的殺傷作用。方法 用不同濃度新城疫病毒（NDV-D90）與卵巢癌細(xì)胞株（SKOV-3）共培養(yǎng)；在不同時(shí)間（6、12、24、48h）觀察SKOV-3細(xì)胞形態(tài)的改變。結(jié)果 NDV病毒作用的SKOV-3細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞溶解和細(xì)胞凋亡；NDV可對SKOV-3胞產(chǎn)生抑制作用，抑制效果與濃度及共同孵育時(shí)間有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 NDV對體外培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，并可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 卵巢癌；NDV；細(xì)胞培養(yǎng)

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2011）23-25-02

The Effect of Newcastle Disease Virus-infected（NDV） on the SKOV-3

SU Lirong

Obstetrics and Gynecology Department，Beijing Municipal Shunyi District Women and Children Health Care Hospital ， Beijing 101300，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of newcastle disease virus-infected（NDV） on the SKOV-3. Methods NDV-D90 in different concentration was cultured with SKOV-3； The SKOV-3 cells were monitored for cell morphological changes under micro scope within 6hours， 12hours，24hours and 48hours respectively. Results The SKOV3 cells infected by NDV become shrinked，dissolved. Cell concentration and apoptotic bodies were observed as well. NDV could effectively inhibit SKOV-3 cell growth， which depends on virus concentration and inoculation time of NDV and the difference of cell growth inhibitory rate among cells was significant（P＜0.01）. Conclusion NDV can inhibit proliferation and induces cell apoptosis in SKOV-3 cells in vitro.

[Key words] Ovarian cancer； NDV；Cell culture

卵巢惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，且手術(shù)和放化療療效不佳，5年生存率較低，成為嚴(yán)重威脅婦科腫瘤患者生命的疾病。卵巢癌傳統(tǒng)的治療常難以治愈，且易復(fù)發(fā)。因此尋找特異性強(qiáng)、敏感性高的卵巢癌相關(guān)抗原，并探索有效的綜合治療方法有重要的臨床意義。腫瘤基因治療給腫瘤治療技術(shù)帶來了新生機(jī)，供選擇的基因有[1]：細(xì)胞因子基因、主要組織相容性復(fù)合體基因、病毒基因和反義基因。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）是近年來興起引起重視的一種病毒，作為病毒基因，它對多種惡性腫瘤具有一定治療作用。 2010年3月~ 2011年1月本研究對此課題進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腫瘤細(xì)胞株卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3購自哈爾濱市腫瘤醫(yī)院細(xì)胞生物所；主要試劑新城疫病毒（NDV-D90）、胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、臺(tái)盼藍(lán)、AO-PI染劑；實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)（蘇州凈化集團(tuán)安泰公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；倒置顯微鏡（OLYMPUS-CK2，Japan）；自動(dòng)雙重純蒸餾水器（上海強(qiáng)申生化儀器廠）；電熱恒溫水浴箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠，GB11241-89）；透射電鏡（日產(chǎn)JEM-1230型）；熒光顯微鏡；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，Japan）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基，加入10%小牛血清、100U/mL青霉素及鏈霉素100μg/mL，細(xì)胞呈貼壁生長。于37℃、5%CO2飽和濕度條件孵箱孵育，每2～3天換液一次。傳代培養(yǎng)時(shí)，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞棄盡培養(yǎng)液，加入新鮮的0.25%胰酶消化37℃孵育5min，待細(xì)胞脫壁后加入新鮮的含小牛血清的培養(yǎng)液中止胰酶反應(yīng)，抽提重懸細(xì)胞，分置細(xì)胞于新的培養(yǎng)瓶中，傳代比例為1∶3；制成細(xì)胞懸液，離心后加培養(yǎng)液10mL重懸細(xì)胞，取0.5mL進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，反復(fù)計(jì)數(shù)三次， 分裝于培養(yǎng)瓶中，放入孵育箱中備用。生理鹽水洗滌兩次，將細(xì)胞調(diào)整為4×107/mL。

1.2.2 受試藥物的配置 NDV在雞胚尿囊液中培養(yǎng)擴(kuò)增，置37℃恒溫箱中72h后取出，4℃冰箱過夜，7520rpm離心15min，取上清液，用HBSS液溶解沉淀，雙蒸水稀釋蔗糖成20%~55%梯度，在4℃，75000rpm離心2h，從蔗糖界面抽吸出純化的病毒，測定NDV濃度為2×108PFu/mL，用PBS液稀釋為108PFu/mL，將病毒分裝凍存。NDV-D90是一種新分離強(qiáng)毒株，血凝效價(jià)2×108PFU/mL和2×109PFU/mL，由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。實(shí)驗(yàn)分組和處理將制備好細(xì)胞懸液分5個(gè)處理組分別接種于培養(yǎng)瓶、6孔培養(yǎng)板和96孔板上，盡量吹打均勻，并做對照，再分別加NDV病毒原液500μL（約含病毒顆粒2×108/PFU）放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，分別于6h、12h、24h、48h分別觀察細(xì)胞生長及死亡情況，并用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)死細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。培養(yǎng)24h取出6孔培養(yǎng)板固定，曬干24h中性樹脂封片備用。NDV稀釋10倍組：NDV50μL稀釋10倍，其余同NDV原液組。NDV稀釋100倍組：NDV5μL給予稀釋100倍，其余同NDV原液；光學(xué)顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡和計(jì)算貼壁率，臺(tái)盼藍(lán)檢測腫瘤細(xì)胞存活率， 細(xì)胞存活率（%）=（細(xì)胞總數(shù)-藍(lán)色細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%；AO-PI染色法（丫啶橙染色法及活細(xì)胞染色）進(jìn)行形態(tài)觀察和指標(biāo)檢測，熒光檢測細(xì)胞凋亡。電鏡檢查當(dāng)CPE（細(xì)胞病變試驗(yàn)）達(dá)80%棄去維持液，用橡皮墊掃刮取細(xì)胞，收集于5mL的EP管中固定，3000r/min離心10min，送電鏡室透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。凋亡細(xì)胞半定量分析400高倍視野下，每個(gè)培養(yǎng)瓶拍攝5個(gè)陽性視野，每視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，以平均計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比作為凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)[（AI）=（凋亡陽性的細(xì)胞核數(shù)÷總計(jì)數(shù)的細(xì)胞核數(shù)）×100]。

1.3 結(jié)果判定

吖啶橙染色后熒光顯微鏡下見NDV作用的癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核呈致密濃染的黃綠色熒光或見黃綠色碎片，亦有少數(shù)黃綠色碎片，染色質(zhì)濃縮到核邊，核碎裂，有的細(xì)胞形成合胞體；PI染色熒光顯微鏡下見正常活細(xì)胞核被PI著染呈紅色；早期凋亡細(xì)胞胞核濃縮，染色加深，或核染色質(zhì)聚集于核膜一邊，呈新月狀；晚期凋亡細(xì)胞胞核碎裂成大小不等的原形小體，并被細(xì)胞膜所包繞，即凋亡小體。病毒作用24h后電鏡下觀察細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)凋亡小體，同時(shí)也見典型的壞死細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用配對t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新城疫病毒（NDV）對人卵巢癌細(xì)胞株（SKOV-3）不同作用時(shí)間殺傷作用

腫瘤細(xì)胞貼壁率光鏡選擇3個(gè)視野觀察腫瘤細(xì)胞貼壁率，隨NDV作用時(shí)間的延長，腫瘤細(xì)胞萎縮、脫落、最后懸浮，貼壁率顯著下降（表1）。

2.2 兩組腫瘤細(xì)胞存活率與貼壁率相比

腫瘤細(xì)胞存活率與貼壁率相比，存活率高于貼壁率，實(shí)驗(yàn)組與對照組存在顯著性差異（P＜0.01）。

2.3 腫瘤細(xì)胞的光鏡觀察

NDV病毒處理24h后人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3見細(xì)胞體積減少細(xì)胞膜皺縮，形態(tài)不規(guī)則，溶解核小體出現(xiàn)，核染色質(zhì)濃縮在核膜下或核的一邊， 可見細(xì)小的碎片，出現(xiàn)大面積細(xì)胞凋亡。未經(jīng)NDV病毒處理的SKOV-3細(xì)胞只見少許凋亡細(xì)胞。

2.4 電鏡檢查

感染病毒48h細(xì)胞作超薄切片、透射電鏡觀察，見NDV作用后SKOV3細(xì)胞形態(tài)改變，腫瘤細(xì)胞感新城疫病毒后，可引起明顯的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化：細(xì)胞胞漿內(nèi)均富含不同發(fā)育階段的病毒顆粒，完整病毒粒直徑約100nm，并形成包涵體；成熟病毒粒子排列成晶格狀，線粒體腫脹、細(xì)胞膜溶解；亦見到核膜結(jié)構(gòu)完整，但核染色質(zhì)濃縮、成塊、邊聚、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張的細(xì)胞，尚可見到大量的病毒空衣殼和未包裝的病毒核物質(zhì)。見圖1。

圖1 NDV 誘導(dǎo)SKVO-3細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變（×50 000）

A：未感染NDV的SKOV-3細(xì)胞； B：NDV作用48h的SKOV-3細(xì)胞；C：未感染NDV的SKOV-3細(xì)胞；D：NDV作用48h的SKOV-3細(xì)胞

2.5 AO-PI染色法檢測凋亡細(xì)胞

AO-PI染色法檢測凋亡細(xì)胞感染病毒24h的細(xì)胞經(jīng)AO-PI染色法后，腫瘤細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色。新城疫病毒作用24h凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)（AI）為9.9%，48h凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)（AI）為17.8%。

3 討論

NDV 是新城疫病毒（NDV），屬副黏病毒科腮腺炎病毒屬成員，屬反義負(fù)鏈RNA病毒，由 Doyle[2]在1927 年首先發(fā)現(xiàn)和分離報(bào)道。本研究將NDV與人卵巢癌細(xì)胞株混合，研究其對人卵巢癌細(xì)胞株和正常人卵巢上皮細(xì)胞的生長抑制作用。結(jié)果表明NDV對人卵巢癌細(xì)胞有抑制作用，對人正常卵巢上皮細(xì)胞作用不明顯，提示NDV在體內(nèi)可能有安全性好、副反應(yīng)小的優(yōu)越性。NDV對絕大多數(shù)腫瘤有選擇性直接殺傷作用，國外將NDV應(yīng)用于臨床未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定新城疫病毒的抗腫瘤作用，直接用新城疫病毒觀察其體外抗腫瘤作用，研究表明，新城疫病毒在體外可抑制瘤細(xì)胞的存活。NDV對卵巢癌有直接的抑瘤作用，使NDV有望在控制卵巢癌微小殘余灶、延緩復(fù)發(fā)、提高生存期和生存質(zhì)量等方面發(fā)揮作用。NDV具有直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及激活免疫功能細(xì)胞，NDV誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或瘤體消退的機(jī)制尚不十分清楚，可能的解釋：①NDV直接作用于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，病毒選擇性地作用于腫瘤細(xì)胞，對正常組織細(xì)胞不起作用。Tzadok-David等[3]研究了NDV對Burkitt淋巴瘤Daudi細(xì)胞的破壞作用，發(fā)現(xiàn)NDV對腫瘤細(xì)胞的裂解機(jī)制可能與細(xì)胞膜的通透性增加有關(guān)。② NDV蛋白與腫瘤細(xì)胞膜部分或完全融合，誘導(dǎo)和加強(qiáng)宿主的細(xì)胞免疫及體液免疫殺傷腫瘤細(xì)胞。③NDV對體內(nèi)外巨噬細(xì)胞抗腫瘤活性具有很強(qiáng)的激活作用；NDV能選擇性地感染腫瘤細(xì)胞并在其中復(fù)制，不感染正常細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)利用NDV-D90強(qiáng)毒株作用于人卵巢癌SKOV3，發(fā)現(xiàn)NDV有明顯的抑制腫瘤作用。蔣文軍等選用NDV Lasota毒株感染多個(gè)人惡性腫瘤細(xì)胞株，亦得出相同結(jié)果。

綜上，新城疫病毒（NDV）促進(jìn)SKOV3卵巢癌細(xì)胞凋亡，對卵巢癌組織具有溶瘤作用，使新城疫病毒成為手術(shù)、化療之外的新選擇。

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（收稿日期：2011-05-23）