后循環(huán)缺血兔大腦后分水嶺區(qū)皮質(zhì)MMP-9和TIMP-1表達的實驗研究

[摘要] 目的 研究動脈粥樣硬化兔在右鎖骨下動脈盜血模型建立下大腦后分水嶺區(qū)皮層中MMP-9和TIMP-1的動態(tài)表達變化情況。方法 30只動脈粥樣硬化兔，隨機分為對照組、盜血后1d組和盜血后3d組，每組10只；取大腦后分水嶺區(qū)皮層，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測MMP-9和TIMP-1的基因表達，并進行比較。結(jié)果 MMP-9在盜血后1d及3d上升，但組間未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異；TIMP-1表達在對照組最低，盜血后1d表達升高，在盜血后3d TIMP-1表達開始下降，但仍高于對照組。統(tǒng)計學(xué)處理后未發(fā)現(xiàn)組間有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論 在該動脈粥樣硬化兔右鎖骨下動脈盜血模型中，分水嶺區(qū)皮層中MMP-9和TIMP-1的基因表達在模型建立后的1d和3d呈現(xiàn)血管重建啟動的變化趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該動物模型引起MMP-9和TIMP-1的表達變化情況需要進一步實驗證實。

[關(guān)鍵詞] 動脈粥樣硬化；腦缺血；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；金屬蛋白酶組織抑制劑-1

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）23-07-10-02

Experimental Study on the Expression of MMP-9 and TIMP-1 in the Cortex of Posterior Brain Watershed Area under the Condition of Posterior Circulation Ischemia

SHOU Tiejun1，2 CHEN Zuoquan3 ZHANG Guiyun4 WU Kun1

1.Medical College of Tongji University，Shanghai 200092，China；2.No. 1 Section of Surgery Department，Ningbo Women and Children’s Hospital，Ningbo 315012，China；3.Neurosurgery Department，No.10 Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200072，China；4.Neurosrugery Department，Tongji Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200065，China

[Abstract] Objective To investigate the dynamic changes of MMP-9 and TIMP-1 in the cortex of the brain watershed area of the atherosclerosis rabbit of right subclavian atery steal model. Methods Thirty healthy male New Zealand white rabbits were randomly assigned to control group，one-day steal model group and three-day steal group （n=10）. With those killed and brain extracted the expressions of the gene of MMP-9 and TIMP-1 were measured by the technique of immunofluorescence PCR，and the differences among groups were analysed. Results As statistically showed，MMP-9 expression was a little higher in the three-day steal group than that in the one-day group，with both higher than that in the control group，although there was no significant difference among groups.TIMP-1 expression was the lowest in the control group，raised in the one-day steal group and began descending in the three-day steal group，but still higher than that in the control group. There was still no significant difference among groups. Conclusion In the right subclavian steal model of atherosclerosis rabbit，the gene and protein expression of MMP-9 and TIMP-1 in the cortex of the brain watershed area in the ond-day steal group and three-day steal group take on a variation trend of vessel reconstruction start，while there is still no significant difference among groups. Whether this model can give rise to the change of the expressions of MMP-9 and TIMP-1 needs to be further proved through experiments.

[Key words] Atherosclerosis；Cerebral ischemia；MMP-9；TIMP-1

動脈粥樣硬化是引起腦卒中最常見的原因。腦動脈粥樣硬化主要發(fā)生在管徑500μm以上的動脈，其斑塊引起管腔狹窄或血栓形成，導(dǎo)致腦部血液供應(yīng)障礙，腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)相應(yīng)功能障礙。不同的血管病變引起的相應(yīng)功能區(qū)病變也不相同。后循環(huán)腦梗死比其他部位梗死更容易致命，并且治療困難。實驗通過結(jié)扎新西蘭大白兔右側(cè)鎖骨下動脈的椎動脈開口近端，實現(xiàn)右側(cè)鎖骨下動脈盜血，降低椎基底動脈及遠端血管的灌注壓，模擬臨床動脈粥樣硬化患者由于動脈狹窄或閉塞導(dǎo)致的后循環(huán)低灌注狀態(tài)，并檢測后分水嶺區(qū)皮質(zhì)MMP-9和TIMP-1基因的動態(tài)表達情況，探討新模型下腦缺血的分子機制，為臨床有效防治該病提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1#8195;動物飼養(yǎng)及模型建立階段

實驗于2010年4月完成設(shè)計并通過開題報告會。30只健康雄性新西蘭兔（體重2.5～3.0kg，）以1%膽固醇+5%蛋黃+5%豬油之高脂飲食配方喂養(yǎng)12周，結(jié)扎兔右側(cè)鎖骨下動脈的椎動脈開口近端[1]，模擬人動脈粥樣硬化后循環(huán)缺血的病理改變過程。

1.2 樣本提取階段

將上述兔分成盜血1d組、盜血3d組和對照組，每組10只，對照組飼養(yǎng)12周后處死，后循環(huán)盜血組分別在術(shù)后第1天、第3天處死，快速斷頭取腦，腦組織在生理鹽水中沖洗后，分別取右側(cè)分水嶺區(qū)皮層置入無菌凍存管，迅速放入液氮罐，深低溫保存待檢。

1.3 實驗室檢測階段

總RNA抽提：取綠豆大小的組織，放入加有800μL TRIzol的5mL離心管（RNA酶free）中，用組織高速分散器勻漿后，在管中加入160μL氯仿，蓋緊管蓋，用手混勻，使體系成粉色乳狀后，12000g離心15min；小心移取上清約400～450μL至新1.5mL管（RNA酶free）中，加入450μL異丙醇，混勻，置于-20℃冰箱助沉30min，12000g離心10min。小心地徹底棄上清。在離心管中加入1mL冰75%乙醇，輕彈管底使沉淀懸浮起來，12000g離心5min。小心地徹底棄上清，并于沉淀處畫圈標記。RNA干燥后，用30μL DEPC處理過的去離子水溶解后取1μL樣本與9μL 1X上揚緩沖液混勻后上樣電泳，其余于-80℃保存。TIMP-1引物序列：上游P5：5’-GCTGCTGCTGCTGTGGCTGGTAG，下游P5：5’-GCTGCTGCTGCTGTGGCTGGTAG；MMP-9引物序列：上游P5：5’-CGGAGACGGGGGAGCTGGATAATG，下游P3：5’-GCGCGGCAGGTCTTCGGAGTAGTT。內(nèi)參照18s引物序列：上游5’-AGTCGCCGTGCCTACCAT-3’，下游5’-CGGGTCGGGAGTGGGTAAT-3’。采用試劑TAKARA DRR037：PrimeScriptreg;RT reagent Kit Perfect Real Time進行RNA的反轉(zhuǎn)錄，PCR擴增。定量檢測，熒光定量檢測結(jié)果采用slan熒光定量5.1軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，統(tǒng)計方法為參數(shù)分析方式。所有統(tǒng)計結(jié)果均采用SPSS13.0軟件中的完全隨機設(shè)計的單因素方差分析模塊（pos-hocone-way ANOVA），比較多重均數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物結(jié)果

盜血實驗組均采用右鎖骨下動脈結(jié)扎法建立后循環(huán)缺血模型，無死亡、無神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙及行為等方面異常。實驗中發(fā)現(xiàn)，右鎖骨下動脈結(jié)扎法建立的后循環(huán)缺血模型是可行的，具有重復(fù)性。

2.2 實驗數(shù)據(jù)與分析（表1）

以上各組數(shù)值均為所測值與18s（內(nèi)參照）的比值，故沒有單位；MMP-9組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.033，P=0.968＞0.05）；TIMP-1組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.812，P=0.455＞0.05）。

3 討論

MMP-9是一種相對分子質(zhì)量為92KD的鋅依賴性內(nèi)肽酶，通過作用于Ⅳ型明膠、層粘連蛋白和纖維粘連蛋白，在細胞外基質(zhì)的降解和重塑中起著重要的作用[21]。TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑。MMP-9與TIMP-1的動態(tài)穩(wěn)定對于維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)非常重要；在腦缺血、缺氧、炎癥等病理誘因下，這一穩(wěn)態(tài)被破壞，MMP-9過量產(chǎn)生，血管通透性增加，細胞外基質(zhì)被過度降解，導(dǎo)致腦水腫等發(fā)生。而動脈粥樣硬化下的腦缺血的發(fā)生，其側(cè)支循環(huán)的建立狀況直接影響到缺血區(qū)血液供應(yīng)的恢復(fù)程度和速度，改善組織細胞的氧和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，有利于缺血性腦血管疾病的治療和康復(fù)。同時，側(cè)支循環(huán)的建立主要在于動脈生成。動脈生成是指原有的阻力型小動脈在動脈閉塞等病理條件下，管腔擴大，管壁重塑，轉(zhuǎn)變?yōu)楣┭蛡?cè)支動脈的過程，其所形成的動脈能夠有效地恢復(fù)動脈阻塞所致缺血區(qū)的血液供應(yīng)[2，3]。基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑能夠使細胞外基質(zhì)降解、促進內(nèi)皮細胞動員而利于細胞遷移，參與動脈生成。因此，通過對腦缺血下MMP-9和TIMP-1表達的實驗研究有助于探討其在側(cè)支循環(huán)建立過程中的分子機制。

近些年來有關(guān)MMP-9在急性腦梗死中的表達、作用的研究非常多，與之相應(yīng)的腦缺血模型（如大腦中動脈盜血模型MCAO）報道也比較多，為基礎(chǔ)和臨床研究提供了很多的實驗依據(jù)。而右側(cè)鎖骨下動脈盜血模型[4]，模擬了臨床動脈粥樣硬化患者由于椎基底動脈狹窄或閉塞導(dǎo)致的后循環(huán)低灌注狀態(tài)，用來研究椎基底動脈系統(tǒng)（即后循環(huán)）缺血下分子機制，為臨床有效防治該病提供新的依據(jù)。

動脈粥樣硬化是導(dǎo)致大動脈狹窄或閉塞的重要原因，在右鎖骨下動脈結(jié)扎后，血流動力學(xué)異常，后循環(huán)灌注壓下降；分水嶺區(qū)為位于大腦皮質(zhì)動脈供血區(qū)之間、基底節(jié)區(qū)小動脈供血區(qū)之間的邊緣帶組織，低血流灌注下更易產(chǎn)生缺血、梗死，同時由于前循環(huán)的部分代償減弱了缺血強度，加之時間窗的選取不足以表現(xiàn)出MMP-9的變化，結(jié)合例數(shù)較少，因此在本次研究中，MMP-9在對照組、盜血1d組和盜血3d組的表達呈現(xiàn)了逐漸升高的趨勢，但是各組間比較在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性意義。與近年來文獻中有關(guān)MMP-9的動態(tài)變化相符合[5-8]。TIMP-1在盜血第一天達到了很高的表現(xiàn)，之后逐漸下降，但仍比對照組高，而在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異。

綜合以上分析，有關(guān)右側(cè)鎖骨下動脈盜血模型下的更多的分子機制的表現(xiàn)有待今后通過增加樣本量和取樣時間窗，引入基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的其他成員，進行進一步深入研究。

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（收稿日期：2011-05-17）