細胞培養法淋巴細胞微核標本的制作過程及注意事項

【摘要】 目的 提高淋巴細胞微核標本的制作及閱片質量。方法 對接觸放射性工作的崗前、在崗及離崗人員抽靜脈血接種于1640培養基進行培養、收獲、制片、染色、閱片。結果 按照平時積累的經驗操作可提高制片及閱片質量。結論 注意操作中的細節問題可提高制片及閱片質量。

【關鍵詞】 淋巴細胞微核； 標本制作； 健康監護； 放射

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淋巴細胞微核測定是細胞遺傳學方法之一，對淋巴細胞微核率的觀察，不僅能早期發現輻射效應，而且還能對受照個體進行生物劑量估算，是《職業健康監護管理辦法》中接觸放射性工作人員進行健康監護中的必檢項目之一^［1］，是評價放射工作者所受輻射損傷的一項非常有意義的指標。為了提高微核的檢出率和閱片效率，應嚴格按照操作規程進行實驗操作。筆者所在實驗室是北京市能夠承擔放射性危害因素職業健康監護工作為數不多的幾家單位之一，現將工作中總結的一些具體的操作方法和注意事項報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本來源 接觸放射性工作的崗前、在崗及離崗人員。

1.2 方法

1.2.1 接種 消毒1640培養基，抽靜脈血接種于1640培養基內混勻，濃度要適當（血量：25～30滴）。瓶上寫清楚受檢者姓名或者實驗室自行編號。

1.2.2 培養 接種后將培養基放于（37±0.5） ℃恒溫培養箱內培養72 h。

1.3 收獲

1.3.1 收集細胞 將細胞懸液混勻倒入編好號的潔凈離心管中，1500 rpm離心5 min，棄上清液。

1.3.2 低滲 加入0.075 mol/L氯化鉀低滲夜5 ml，用滴管輕打混勻，低滲10 min。

1.3.3 預固定 加入1 ml固定液，輕輕混勻后1500 rpm離心5 min。固定液為甲醇:冰醋酸（3∶1）。

1.3.4 固定 棄上清液，加入5 ml固定液，輕輕混勻，靜置10 min，1500 rpm離心5 min，棄上清液。重復操作固定步驟2～3次，直至固定液透明為止。

1.3.5 制懸液 棄上清液后，視細胞數量多少加入適量固定液打勻。

1.3.6 滴片 吸取細胞懸液滴在一張潔凈的4 ℃濕的載玻片上，輕吹散，風干，及時正確編號。

1.3.7 染色 Giemsa染液染色20 min左右，細水沖洗多余染液，風干。

1.3.8 鏡檢 光學顯微鏡下計數1000個胞體完整、已轉化的淋巴細胞，計數淋巴細胞微核，以千分率（‰）表示。

1.3.9 微核判定標準 微核應位于完整的淋巴細胞胞漿內，與主核完全分開（如有重疊或相切，必須看到各自的完整核膜），呈圓形或橢圓形，結構與主核相同，著色與主核一致或略淺，不折光，大小為主核的1/3以下的小核^［2］。

1.4 好片的評價標準 細胞數量多、分布均勻、密度適中、染色清晰、核漿分明、透明度好。

2 注意事項

2.1 要嚴格進行消毒，避免細胞在培養過程中細菌污染，影響制片效果及閱片。

2.2 接種血液量要適當，太多不容易打散，太少不易觀察。以5 ml注射器接種約25～30滴為宜。

2.3 培養溫度應嚴格控制在（37±0.5）℃。

2.4 低滲的目的是使紅細胞膜破裂，淋巴細胞膨脹。低滲過度，淋巴細胞也會破裂；低滲不足則胞漿厚，可能使微核漏檢。低滲液的量、處理時間均與細胞的數量有關。低滲處理濃度及時間要適當，且低滲后混勻細胞時一定要輕，否則會引起膜破裂。

2.5 離心速度過高或時間過長，細胞團不易打散或細胞破碎；反之，細胞易丟失。

2.6 固定液應在使用前新配制。微核制備操作過程中最關鍵的步驟是低滲處理，根據接種血液量多少決定加低滲液量的多少，將培養物全部轉入潔凈離心管后，應盡快加入固定液進行預固定。

3 討論

淋巴細胞微核是細胞的染色體發生斷裂之后，細胞進入下一次分裂時，染色體片段不能隨著有絲分裂進入子細胞，而在胞漿中形成直徑小于主核1/3的碎片，它可以是整條染色體，也可以是染色體片段，嗜色性和主核一致，完全與主核分開的圓形或橢圓形的微小核。各種理化因素作用于細胞染色體，影響其正常的功能，使細胞的DNA復制和染色體分裂受到破壞，紡錘體的功能受到影響產生微核，是染色體畸變間期表現出的一種損傷類型。微核率可以反映致畸因素對細胞的損傷程度和染色體穩定性^［3］。淋巴細胞微核測定是放射工作人員職業健康檢查的特殊檢查項目，是最直接反映輻射損傷的檢查項目之一。隨著核科學的快速發展，放射工作人員逐漸增加以及職業病防治法的頒布實施，職業健康檢查日益受到重視，參加職業健康檢查的放射工作人員逐年增多。淋巴細胞微核測定的特點是：測定對象為活的細胞，全部為手工操作、環節多、時間長，易受各種因素的影響而導致結果的偏離。這就要求必須做好每一步工作，才能制備出良好的淋巴細胞微核片，提高淋巴細胞微核檢出率和閱片效率，及時準確反映輻射損傷情況。

淋巴細胞微核標本的制作每一步都非常關鍵，出現失誤就會導致片子質量出現問題，影響檢查結果。實驗人員應嚴格按照操作規程進行實驗操作，以確保微核標本片的制備質量，提高微核檢出率和閱片效率，及時準確反映輻射損傷情況，對輻射防護作出正確評價，對放射工作人員的健康進行監護，對意外照射、突發事件估算劑量，為放射患者診斷和治療提供可靠依據。

參 考 文 獻

［1］ 北京市衛生局.《職業健康監護管理辦法》附件1［R］.職業衛生文件匯編（一），2000:47-48.

［2］ WS/T187-1999.淋巴細胞微核估算受照劑量方法［M］.北京:中國標準出版社，1999:146.

［3］ 李冬盎，官瑞霞.淋巴細胞微核在國內職業病防治中的應用［J］.現狀實用醫藥雜志，2006，12(23):1512.

（收稿日期：2011-10-23）

（本文編輯：王宇）