中間層在成釉細胞分泌期的礦化相關因子表達研究

【摘要】 目的 探討牙胚中間層細胞在釉質分泌與礦化過程中的礦化相關因子的表達。方法 取出生后1、3、5、7、9、11、13、15 d的BALB/c小鼠，HE染色法進行中間層發育情況的組織學觀察，選擇出生后7 d和13 d標本免疫組化檢測TNSALP、E-cad、OC、BSP、OPN、FM、BGN、DCN在中間層和成釉細胞的表達。結果 在釉質形成的階段，TNSALP、E-cad、OC、BSP、OPN、DMP1和FM在中間層和成釉細胞中有陽性表達，TNSALP、E-cad在中間層的陽性表達先于成釉細胞，隨分泌過程陽性表達由中間層轉移到成釉細胞；BSP、OPN、DMP1和FM在中間層和成釉細胞陽性表達僅見于成釉細胞分泌的后期，分泌早期未見陽性表達。結論 中間層對成釉細胞的分泌功能發揮起支持或誘導作用，中間層細胞與成釉細胞的上皮間礦化相關分子的表達對成釉細胞的分泌具有重要的調控作用。

【關鍵詞】 中間層； 成釉細胞； 牙胚； 發育； 信號分子； 免疫組織化學

Development and immunolocalization of stratum intermedium in secretion stage of ameloblasts YU Xi-jiao，TANG Kai-liang，XUE Lan-de，et al.Stomatology Hospital of Jinan， Jinan 250001，China

【Abstract】 Objective To study expression of mineralization-related signaling molecules in stratum intermedium and ameloblasts，to understand the role of stratum intermedium and their interaction in the secretion stage of ameloblasts.Methods BALB/c postnatal mice were applied to study the development of stratum intermedium during the secretion of enamel.PV two steps immunohistochemical method was used to localize the distribution of TNSALP、E-cad、OC、BSP、OPN、 BGN、DCN and FM in the enemal organ of day 7 and day 13 old mice.Results TNSALP、E-cad、OC、BSP、OPN、DMP1 and FM were positively expressed in stratum intermedium and ameloblasts.The expression of TNSALP and E-cad in stratum intermedium was earlier than that in ameloblasts，and a spatio-temporal expression pattern could be observed during enamel formation. BSP、OPN、DMP1 and FM were positively expressed in stratum intermedium and ameloblasts in late secretion stage of ameloblasts， but negatively in early stage.Conclusion Stratum intermedium is essential in the secretion stage of ameloblasts， meanwhile，the expression of mineralization-related signaling molecules in stratum intermedium and ameloblasts plays an important regulating role during the formation of enamel.

【Key words】 Stratum intermedium; Ameloblast; Tooth germ; Development; Signaling molecule; Immunohistochemistry

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牙齒發育過程是上皮與間充質間交互信號誘導的復雜的多階段過程，上皮來源的中間層、成釉細胞和間充質來源的成牙本質細胞、成牙骨質細胞等細胞的信號誘導對于牙齒的發育特別是牙齒形態發生起決定作用。目前研究多集中于成釉質和成牙本質的上皮-間充質誘導和早期中間層細胞和內釉上皮細胞的上皮-上皮誘導，對于釉質分泌期的中間層和成釉細胞間信號作用研究較少見。本研究觀察小鼠釉質分泌期中間層的組織學發育，并對非特異性堿性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TNSALP）、E鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）、骨鈣素（Osteocalcin，OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨橋素（osteopontin，OPN）、牙本質基質蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）和富含亮氨酸的小分子蛋白多糖 (small leucime-rich proteoglycans，SLRPs)家族的纖維調節素(fibromodulin， FMN)、雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan，BGN)、核心蛋白多糖(decorin，DCN)等礦化信號分子在成釉細胞分泌期的中間層和成釉細胞中的表達進行組織學定位，探討中間層細胞與成釉細胞的上皮間礦化信號分子表達及中間層細胞的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設備 出生后不同發育期SPF級BALB/c小鼠(山東大學動物中心提供)；TNSALP、E-cad、OC、BSP、OPN、DMP-1、FM、BGN和DCN多克隆抗體由Larry W. Fisher 博士 (National Institute of Dental and Craniofacial Research， Maryland， USA)饋贈；多聚賴氨酸(SIGMA-ALDRICH CO.USA)；PV二步法免疫組化檢測試劑盒及DAB試劑盒(邁新生物技術公司)；LEICA RM2135切片機（德國）；OLYMPUS CX71顯微鏡及照相系統（日本）。

1.2 實驗分組及標本處理 本研究共需小鼠21只，選取出生后第1、3、5、7、9、13和15天的小鼠各3只，將小鼠引頸處死，分離解剖含下頜第一磨牙區下頜骨，新鮮配制4%多聚甲醛固定過夜，根據發育時期的不同，甲酸-甲酸鈉復合脫鈣液脫鈣0～4周不等。梯度乙醇脫水，石蠟包埋，近遠中向5 μm連續切片，多聚賴氨酸包被的玻片撈片，60 ℃烤片2～3 h。HE染色觀察釉質分泌期中間層發育的情況。將出生后7 d和13 d的標本用于免疫組化檢測。

1.3 礦化相關信號分子在小鼠牙釉質形成初期表達的組織學定位與觀察 采用免疫組化PV二步法對TNSALP、E-cad、OC、BSP、OPN、DMP-1、FM、BGN和DCN的表達進行組織學定位。取出生后7 d和13 d小鼠磨牙的標本，二甲苯脫蠟，梯度水化至水，3%過氧化氫室溫孵育5 min，以阻斷內源性過氧化物酶，復合消化液消化5 min，蒸餾水洗，血清封閉，室溫孵育20 min，不洗，滴加一抗（FM、BGN和DCN為1:2000，其他為1：100稀釋）37 ℃孵育1 h，PBS漂洗，羊抗鼠IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗，DAB溶液顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并照相。陰性對照片用PBS分別代替一抗或二抗，以成骨肉瘤組織作陽性對照。

1.4 結果判定標準 根據本研究實驗結果結合文獻設定標準如下：（1）陰性表達(-)：細胞質內無淡黃色及棕黃色顆粒，蘇木素復染后呈藍色者。（2）弱陽性表達(+)：細胞質內淡黃色，或陽性著色低于該組織結構的10%。（3）陽性表達（++）細胞質內淡黃或棕黃色顆粒占該組織結構的10%～60%，染色清晰。（4）強陽性表達(+++)：細胞質內淡黃或棕黃色顆粒占該組織結構的60%以上，染色強。

2 結果

2.1 釉質分泌期的中間層組織學觀察 中間層的發育過程自成釉器分化為內釉上皮、中間層、星網狀層和外釉上皮四層結構開始，伴隨內釉上皮分化為成釉細胞和成釉細胞的分泌過程，到釉質分泌完成后逐漸消失。從開始的2～3層細胞結構到單細胞結構；從細胞排列緊密，與周圍組織界線清楚到細胞排列疏松，與周圍組織界線逐漸不清，不易辨認。具體見圖1。

圖中A：出生后1 d的小鼠牙胚成釉器已分化為內釉上皮、中間層、星網狀層和外釉上皮四層結構。可見內釉上皮呈柱狀或高柱狀，釉牙本質界限清楚，中間層為2～3層細胞組成的條帶結構，胞核明顯，呈橢圓形。其外周為疏松的星網狀層。B：出生后3 d，內釉上皮分化為高柱狀的成釉細胞，可見釉質和牙本質分泌，緊鄰成釉細胞的中間層結構清楚，由1～2層細胞組成，細胞之間連接緊密，星網狀層結構開始萎縮，外釉上皮和成釉細胞層之間距離變短。C、D：出生后5～9 d，成釉細胞呈高柱狀，可見大量釉質和牙本質的分泌；中間層呈明顯的單細胞結構，細胞排列緊密，與周圍組織的界限清楚。E：出生后13 d，成釉細胞繼續分泌，成釉細胞高度降低；中間層細胞呈單細胞層結構，細胞排列較前疏松，中間層細胞結構與周圍界限逐漸模糊。F：出生后15 d，釉質分泌基本完成，牙齒部分萌出，中間層結構辨認不易。

2.2 礦化相關信號分子的免疫組化結果見表1。出生7 d，成釉細胞分泌的早期見圖2。中間層的陽性表達為ALP、E-cad和OC，成釉細胞僅OC陽性表達。SLRPs家族的BGN、DCN和FM表達主要位于牙槽骨和前期牙本質，在中間層、星網狀層和成釉細胞中未見表達；骨相關的非膠原糖蛋白BSP和OP表達主要在牙槽骨，DMP1在前期牙本質也有陽性表達。出生后13 d，成釉細胞的分泌后期見圖3。

注：E-cad的表達主要位于中間層和牙槽骨，成釉細胞未見陽性表達。TNSALP在中間層呈強陽性表達，在成牙本質下層和牙槽骨陽性表達，成釉細胞陰性。OC的陽性表達較廣泛，在牙槽骨、中間層、成釉細胞和都有弱陽性表達。BSP和OPN的表達主要在牙槽骨，DMP1在前期牙本質陽性表達。BGN、DCN和FM表達主要在牙槽骨和前期牙本質，在中間層、星網狀層和成釉細胞中未見表達

注：E-cad的陽性表達位于中間層、成釉細胞和牙槽骨。此時TNSALP在成釉細胞強陽性表達，牙槽骨、中間層、前期牙本質呈陽性表達。OC在牙槽骨、中間層、成釉細胞和前期牙本質都呈陽性表達。BSP和OPN在牙槽骨、中間層和成釉細胞都出現陽性表達。DMP1牙槽骨、中間層、成釉細胞和前期牙本質陽性表達。SLRPs 家族的FM 陽性表達位于牙槽骨、中間層、成釉細胞和前期牙本質，此時BGN和DCN的表達主要仍在牙槽骨和前期牙本質，BGN在中間層和成釉細胞區有弱陽性表達ALP、E-cad和OC在中間層和成釉細胞都為陽性表達；BGN、DCN 、DMP1和FM在中間層和成釉細胞出現陽性表達；SLRPs家族的DCN在中間層和成釉細胞仍未見陽性表達，BGN雖有表達但表達較弱，其在前期牙本質仍為陽性表達。這些信號分子在牙槽骨都有陽性表達。

3 討論

牙齒的發育作為一個上皮-間充質、上皮-上皮交互誘導發揮重要作用的復雜的多階段過程，中間層細胞雖然數量不多，但其位置特殊，緊靠不同分化狀態的內釉上皮并伴隨整個內釉上皮的分化過程和成釉細胞的分泌過程，由開始時的2～3層細胞結構演變為單細胞結構，并隨成釉細胞分泌的結束逐漸消失。對牙胚發育的早期研究發現，中間層細胞表現高度的堿性磷酸酶活性，認為其可能具有誘導或促進內釉上皮分化的作用^［1］。Mass等^［2］通過對Msx2基因敲出鼠的發育中牙胚進行觀察，發現中間層發育缺陷，牙胚的成釉細胞分化和釉質分泌中止。可以預見中間層及其與內釉上皮/成釉細胞的交互作用對釉質的正常發育是必不可少的，中間層在牙胚發育特別是形態發生中發揮關鍵作用^［3］。

本研究選擇牙胚發育早期參與內釉細胞分化的TNSALP和介導同型細胞間的粘附，細胞間鈣離子轉運及細胞的極化起重要作用的E-cad^［4］，骨/本質礦化相關的非膠原糖蛋白OC、BSP、OPN、DMP-1和同樣作為礦化基質成分的亮氨酸豐富小分子的蛋白多糖FM、BGN和DCN^［5］，進行釉質分泌期中間層和成釉細胞的可能礦化相關信號分子的表達研究。Goldberg等^［6］通過對BGN和DCN基因敲出鼠的對比研究發現，BGN基因敲除鼠的牙本質涎蛋白在成牙本質細胞和成牙本質細胞下層過表達，而BSP、OPN和DMP1的表達下調。DCN基因敲除鼠中BSP、OPN和DMP1的表達則上調，各種不同的礦化相關因子之間及同種類型因子之間可能存在相互的調節作用，而牙齒的發育作為一個上皮-間充質交互誘導發揮重要作用的復雜的多階段過程，必然是各種不同信號分子相互協調、相互拮抗的合力作用結果。

本研究發現，TNSALP和E-ca具有類似時空性表達改變，中間層都先于成釉細胞陽性表達，第7天的中間層TNSALP強陽性表達，E-ca陽性表達，成釉細胞陰性表達。第13天成釉細胞則出現TNSALP強陽性表達和E-ca陽性表達。呈現從中間層細胞到成釉細胞的陽性表達轉移，提示中間層在釉質分泌過程中可能為成釉細胞功能的正常發揮提供支持或前期準備。OC、BSP、OPN、DMP-1都是骨/牙本質基質礦化的重要非膠原糖蛋白，同礦化的發生密切相關，在釉質分泌后期的第13天，中間層和成釉細胞呈OC、OPN 、DMP-1、FM陽性表達，但僅OC在第7天同樣陽性表達，SLRPs家族的BGN表達類似FM，但表達較弱。這些信號分子雖參與了釉質的分泌和礦化，但不同信號分子表達具有階段性，不同時段可能是不同的礦化信號分子起主導作用。與BGN具有相反調節作用的DCN則在整個成釉細胞分泌期的中間層和成釉細胞未見陽性表達，提示同為SLRPs家族的FM比BGN和DCN在成釉細胞分泌期發揮更為積極的作用。

從結果可以看到，TNSALP、E-ca、OC、BSP、OPN、DMP-1和FM是釉質分泌過程中的相關礦化信號分子，對釉質正常分泌發揮作用。釉質形成期中間層的TNSALP、E-cad和OC等礦化信號分子陽性表達可能與礦化的所需的鈣磷轉運有關^［7］。血液中的鈣磷等成分要到達成釉細胞，就需通過中間層，血液中鈣磷濃度隨個體攝入不同，不同時間差異較大，且與成釉細胞分泌所需濃度有著很大差異。因此，筆者認為除了磷酸鹽和營養物質轉運功能外^［8］，中間層細胞在釉質分泌期可能還具有某種鈣磷的濃縮功能和匯儲功能，使鈣磷達到某種濃度后，再轉運給成釉細胞，從而有利于成釉細胞分泌的順利完成。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2011-10-24）

（本文編輯：陳丹云）