宮頸癌患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群的檢測(cè)及臨床意義

摘 要 目的：檢測(cè)宮頸癌患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的數(shù)量以及血清中IL-10及TGF-β的表達(dá)水平，探討B(tài)r1在宮頸癌臨床監(jiān)測(cè)中的意義。方法：收集50例宮頸癌患者外周血標(biāo)本，用間接免疫熒光法檢測(cè)Br1細(xì)胞亞群的分布，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中IL-10及TGF-β的表達(dá)情況。結(jié)果：宮頸癌患者外周血Br1的數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組，IL-10的含量均明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），宮頸癌浸潤(rùn)組與正常對(duì)照組相比，Br1的數(shù)量及IL-10明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論：宮頸癌患者中Br1的數(shù)量及血漿IL-10明顯升高，提示Br1細(xì)胞與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能存在著一定的關(guān)系。

關(guān)鍵詞 宮頸癌 調(diào)節(jié) B細(xì)胞

AbstractObjective:To detect the levels of Breg in PBMC and IL-10 and TGF-β expression in seria in cervical carcinoma patients，for evaluating the significance of Breg cells in cervical clinical monitoring.Methods:Br1 subsets in peripheral blood were detected by indirect immunofluorescent staining and the expression level of IL-10 and TGF-β were detected by ELISA in 50 cases with cervical carcinoma.Results:The proportion of Br1 increased in comparison with normal control（P＜0.05）.The expression levels of IL-10 expression in patients'seria were higher than those of control groups （P＜0.05）;the levels of plasma IL-10 were significantly higher in patients with infiltration as compared with patients with control groups（P＜0.05）.Conclusion:Predominant expression of IL-10 in cervical cancer patients suggests that Br1 cells may involve in the development of cervical cancer.

Key Wordscervical carcinoma;development;Breg

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科腫瘤之一，其確切的病因仍未明確。普遍認(rèn)為，高危性人乳頭瘤病毒（high risk human papillomavirus，hrHPV）的感染是導(dǎo)致宮頸癌的主要原因之一^［1］。還有研究表明，宮頸癌的發(fā)生同時(shí)受其他因素影響，如患者細(xì)胞免疫功能低下^［2］。

新近研究提示，除分泌抗體的致病性B細(xì)胞外，還存在分泌IL-10或TGF-β等細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cells，Bregs），分別稱為產(chǎn)生IL-10的Br1細(xì)胞或TGF-β1的Br3細(xì)胞^［3，4］。Bregs通過(guò)產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子或分泌抑制性抗體影響其他免疫細(xì)胞的功能，減緩炎癥癥狀。而慢性炎癥又是腫瘤的主要誘發(fā)因素^［5］，Br1細(xì)胞及其分泌的IL-10可存在于多種慢性炎癥疾病，表明Br1細(xì)胞參與慢性炎癥的病理機(jī)制。

為了深入探討B(tài)reg細(xì)胞亞型與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，本文針對(duì)不同病程的宮頸癌患者外周血Br1細(xì)胞亞群及血清中IL-10及TGF-β水平進(jìn)行檢測(cè)，以期找到Breg細(xì)胞亞型在宮頸癌診斷、治療及預(yù)后中的作用。

資料與方法

主要試劑：兔抗人CD 5抗體（FITC）和CD 19抗體（PE）為Santa公司產(chǎn)品，IL-10及TGF-β的ELISA檢測(cè)試劑盒為北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分層液為sigma產(chǎn)品。

臨床資料及標(biāo)本：2007年12月～2010年12月宮頸癌患者外周血。所有患者術(shù)前均未做過(guò)放化療，患者年齡25～70歲，平均47歲。根據(jù)1995年FIGO修訂的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)50例標(biāo)本中Ia期5例，Ib期8例，Ⅱ a期13例，Ⅱb期20例，Ⅲ期4例。組織分化程度：高分化7例，中分化20例，低分化23例。取同期子宮肌瘤切除的正常宮頸25例作為正常對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)方法：間接免疫熒光法：外周血1ml，肝素抗凝。用淋巴細(xì)胞分層液分離單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗2次，計(jì)數(shù)。取106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，分別加入抗CD 5抗體和抗CD 19抗體20μl，將標(biāo)本與抗體充分混勻后，30溫育1小時(shí)。取出后用2ml紅細(xì)胞裂解液裂解10分鐘，離心后棄上清，用PBS洗2遍，上流式細(xì)胞儀做熒光檢測(cè)。

ELISA：常規(guī)收集血清，IL-10含量測(cè)定采用ELISA法，按試劑盒說(shuō)明書操作，在450nm處讀取光密度值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用EXCEL軟件處理數(shù)據(jù)，各計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)；兩因素相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α0.05，以P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

宮頸癌患者外周血Br1亞群數(shù)量與疾病的關(guān)系：見(jiàn)表1，宮頸癌患者外周血中Br1亞群所占的比例增多，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。分化程度越低，Br1的所占的比例就越多，中低分化的宮頸癌患者Br1亞群數(shù)量明顯高于高分化組（圖1-左）。并且隨著浸潤(rùn)程度的增加，Br1的數(shù)量增加的越多（圖1-右）。

Br1細(xì)胞通過(guò)分泌IL-10抑制腫瘤患者的免疫功能：宮頸癌患者血清IL-10水平與分化程度呈負(fù)相關(guān)，分化程度越低，血清IL-10的水平越高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表2可見(jiàn)，宮頸癌患者血清IL-10水平隨著浸潤(rùn)程度的增加而增加，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而TGF-β的變化則沒(méi)有IL-10明顯，中低分化的宮頸癌患者雖然TGF-β有所增加，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也不隨分化程度及浸潤(rùn)程度的變化而變化。見(jiàn)表1。

討 論

1996年，Janeway等^［6］首先報(bào)導(dǎo)了具有免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞亞群，此類細(xì)胞與多種疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、糖尿病、多發(fā)性硬化癥及腫瘤相關(guān)^［7，8］。Bregs主要經(jīng)由炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生，以此抑制炎癥過(guò)度反應(yīng)引起的組織損傷，加速機(jī)體恢復(fù)進(jìn)程。Bregs可通過(guò)分泌細(xì)胞因子或抗體，也可通過(guò)直接或間接的作用，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而在腫瘤患者中，Bregs可通過(guò)抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞抑制自身免疫，也可以通過(guò)抑制細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性減弱抗腫瘤免疫^［9］。

而我們的研究結(jié)果提示，在宮頸癌中，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群（Br1）的數(shù)量要比正常對(duì)照組多，說(shuō)明該亞群反應(yīng)了宮頸癌患者的免疫狀態(tài)。而通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血清中與免疫抑制有關(guān)的免疫分子發(fā)現(xiàn)，血清中起主要抑制免疫作用的效應(yīng)分子是IL-10而不是TGF-β，這從另一個(gè)角度證明在宮頸癌中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞主要以Br 1亞群存在。

Inoue等研究表明，B細(xì)胞CD 40和腫瘤細(xì)胞CD 40L相互作用，可誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，從而抑制CD 8+ T細(xì)胞的生物學(xué)活性，降低CD 8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ水平；B 細(xì)胞缺失可增加機(jī)體對(duì)腫瘤的原發(fā)性排斥^［9］。此外，B細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10 可能與體外IFN-γ反應(yīng)性降低有關(guān)。Bregs產(chǎn)生的IL-10可以抑制IL-6和IL-12在樹突狀細(xì)胞（DC）中的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步抑制TH 1和TH 17細(xì)胞的發(fā)育^［8-10］。Bregs能否像Tregs一樣代表獨(dú)立的調(diào)節(jié)性細(xì)胞以及調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。此外，負(fù)責(zé)Bregs調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子也需要進(jìn)一步研究。

Bregs的發(fā)現(xiàn)及功能研究使特異性誘導(dǎo)/祛除Bregs，從而達(dá)到治療各種疾病如腫瘤、感染和自身免疫性病等疾病成為可能，但特異性祛除Bregs更能增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，似乎是更有前景的治療方法。但是，怎樣才能有效地特異祛除Bregs的方法還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

1 Goncalves MA，Donadi EA.Immune cellular response to HPV:current concepts.Braz J Infect Dis，2004，8（1）:1-9.

2 Bais AG，Beckmann I，Lindemans J，et al.A shift to a peripheral The type cytokine pattern during the carcinogene sis of cervical cancer becomes manifest in CIN Ⅲ lesions.J Clin Pathol，2005，58（10）:1096-1100.

3 Noh J，Choi WS，Noh G，Lee JH.Presence of Foxp3-expressing CD19（+）CD5（+） B Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells:Human CD19（+）CD5（+）Foxp3（+） Regulatory B Cell （Breg） Immune Netw.2010，10（6）:247-9.

4 Lee JH，Noh J，Noh G，Choi WS，Cho S，Lee SS.Allergen-Specific Transforming Growth Factor-β-Producing CD19（+）CD5（+） Regulatory B-Cell （Br3） Responses in Human Late Eczematous Allergic Reactions to Cow's Milk. J Interferon Cytokine Res，2011，F(xiàn)eb 3.［Epub ahead of print］

5 Karin M，Lawrence T，Nizet V.Innate immunity gone awry:linking microbial infections to chronic inflammation and cancer.Cell，2006，124（4）:823-835.

6 Wdf S D，Janeway C A，Dittel B N，et al.Experimental autoimmune encephalomyelitis induct ion in genet ically B cell deficient mice［J］.J Exp Med，1996，184（6）:2271-2278.

7 Inoue S，Scott D，Golding B，et al.Regulatory B cells inhibit antitumor immunity.Cancer Res，2007，67:5059.

8 Fillatreau S，Gray D，Anderton SM.Not always the bad guys:B cells as regulators of autoimmune pathology.NatRev Immunol，2008，8:391-397.

9 Inoue S，LeitnerWW，Golding B，et al.Inhibitory effects of B cells on antitumor immunity.Cancer Res，2006，66:7741-7747.

10 Sun C-M，Deriaud E，Leclerc C，et al.Upon TLR9 tignaling，CD5 + B Cells control the IL2122dependent Th12p riming capacity of neonatalDCs.Immunity，2005，22:467-477.

表1 IL-10及TGF-β在不同病理分化程度中的陽(yáng)性表達(dá)

表2 IL-10及TGF-β在宮頸癌患者不同浸潤(rùn)深度中的表達(dá)

圖1 宮頸癌患者中Br1的數(shù)量