同步硝化反硝化細(xì)菌的鑒定與脫氮特性研究

摘 要：依據(jù)同步硝化反硝化脫氮原理，以生活污水處理廠污泥為種泥，利用15 ℃低溫?fù)u床富集并分離出同步硝化反硝化細(xì)菌（SNDB5），采用傳統(tǒng)與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合的手段對其鑒定， 以確定其分類地位；利用水浴搖床研究SNDB5對硝化細(xì)菌液體培養(yǎng)基NO2--N的去除效果。結(jié)果表明：SNDB5與 Pseudomonas mendocina同源性達(dá)99.0 %， 形態(tài)特征、革蘭氏染色及生理生化與Pseudomonas mendocina最相似， 屬假單胞菌屬；搖床培養(yǎng)反應(yīng)條件顯示，當(dāng)NO2--N濃度加大到150 mg/L時，菌株SNDB5的活性受到了抑制。

關(guān)鍵詞：同步硝化反硝化； 16S rDNA 序列； 好氧脫氮

中圖分類號：X703.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：16744764（2012）05013605

近年來，中國廣泛開展了脫氮方面的研究，并且取得了階段性的進(jìn)展。在已經(jīng)開發(fā)的廢水脫氮方法中，生物脫氮法是目前公認(rèn)的最為經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。在硝化反硝化生物脫氮過程中，參與硝化的主要微生物硝化菌為自養(yǎng)菌，生長緩慢，世代時間長，需要較長的污泥齡，使得硝化成為城市污水處理廠的制約因素[1]。

不少研究和報道[24]已充分證明，反硝化可發(fā)生在有氧條件下，使得有關(guān)好氧硝化反硝化生物脫氮的研究日趨活躍。目前已知的好氧硝化反硝化菌有：糞產(chǎn)堿菌[5] （Alcaligenes faecalis），泛養(yǎng)硫球菌[6]（Thiosphaera pantotropha），現(xiàn)更名為脫氮副球菌[7] （Paracoccus denitrificans）和赤紅紅球菌[8]（Rhodococcus ruber）等，它們能同時利用氧和硝酸作為電子受體以獲得高生長率。已有報道[9]Pseudomonas mendocina是典型的反硝化細(xì)菌， 具有較強(qiáng)的反硝化活性， 當(dāng)硝酸鹽濃度為88.5 mg/L 時， 反硝化速率最大， 為26.2 mg/（L·d），顯現(xiàn)出較強(qiáng)的厭氧氨氧化能力。利用好氧同時硝化反硝化菌發(fā)展好氧脫氮技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）使硝化/反硝化反應(yīng)在同1個反應(yīng)器中進(jìn)行，可以大大減少占地面積和建設(shè)資金；2）使用好氧反硝化細(xì)菌可以減少處理過程中加入調(diào)節(jié)系統(tǒng)pH的化學(xué)物質(zhì)，降低成本；3）在處理過程中好氧反硝化菌更容易控制[10]。因此新型好氧反硝化微生物的篩選和好氧同時硝化反硝化生物脫氮技術(shù)已經(jīng)成了生物脫氮領(lǐng)域新的研究和發(fā)展趨勢。同時，污水處理中微生物的代謝情況與溫度有關(guān)，隨著溫度降低微生物活性下降，當(dāng)溫度低于4 ℃時，微生物的生理活動幾乎停止。北方冬季的低溫條件會對微生物的生存造成很大影響，水溫過低，會影響細(xì)菌的增殖速率和生理活性，同樣會使硝化反硝化作用停止。少數(shù)微生物會因?yàn)榛蛲蛔兌a(chǎn)生抗寒性，因此可以通過人工選擇的方式來培養(yǎng)耐低溫優(yōu)勢菌種，使其在低溫下仍有較強(qiáng)的脫氮能力[11]。〖=D（〗 張 巍：同步硝化反硝化細(xì)菌的鑒定與脫氮特性研究〖=〗

筆者依據(jù)好氧硝化反硝化脫氮的原理， 采用低溫?fù)u床富集、篩選具有硝化作用的反硝化脫氮菌， 利用傳統(tǒng)與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合手段進(jìn)行同步硝化反硝化短程脫氮菌分離并鑒定確定其分類地位。為富集高效硝化反硝化短程脫氮菌， 提高硝化反硝化脫氮過程的效率， 開發(fā)高效節(jié)能低耗的硝化反硝化短程脫氮工藝提供理論依據(jù)。1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用菌種來源于遼寧省昌圖污水處理廠A/O裝置中的好氧活性污泥。其他化學(xué)試劑均為市售分析純。基因組DNA抽提試劑盒， 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 分析儀器

分光光度計（ UNICO UVTU1901）；電子天平（LP502A）；pH 計（ 上海雷磁， pHs3c）， 離心機(jī)（TDZ5WS）；生化培養(yǎng)箱（SPX100BZ）；高壓滅菌鍋（HVE50 AUTOCLAVE）；電子顯微鏡（OLYMPUS CX41KF）；BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng) （美國 microLog）；恒溫水浴搖床（英國 OLS200）。

1.3 分析方法

菌體濃度測定采用分光光度法測定[12]。CODCr 測定采用重鉻酸鉀法，NH4+-N采用納氏分光光度計法[13]。

1.4 培養(yǎng)基

用于富集培養(yǎng)降解同步硝化反硝化細(xì)菌的培養(yǎng)基配方為： NaNO2 0.5 g、牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、pH 7.0[14]。

用于分離純化同步硝化反硝化菌的培養(yǎng)基配方為：NaNO2 1.0 g、Na2CO3 1.0 g、NaH2PO4 0.25 g、CaCO3 1.0 g、K2HPO4 0.75 g、MnSO4 0.01 g、MgSO4·4H2O 0.03 g、H2O 1 000 mL、瓊脂15 g。

1.5 菌株的富集與分離

將好氧污泥接種于4瓶250 mL 富集培養(yǎng)基中，每瓶污泥接種1.0 mL， 搖床培養(yǎng)， 搖床溫度為15 ℃， 轉(zhuǎn)速120 r ·min-1。4 d 后， 將富集好的菌液稀釋后涂布于20 個裝有分離培養(yǎng)基的平板上。將平板置于溫度為15 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 定期觀察菌體的生長情況。用接種環(huán)將平板上生長良好的菌落挑出， 劃線培養(yǎng)于分離培養(yǎng)基中， 翻接8～10次， 將菌株分離。將分離出的菌株， 劃線于普通肉汁斜面， 4 ℃冰箱保藏。

1.6 菌株的生理生化鑒定

參照《菌種保藏手冊》[15] 和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[16] ， 對SNDB5進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.7 BIOLOG鑒定

BIOLOG鑒定系統(tǒng)由濁讀儀、讀數(shù)儀、數(shù)據(jù)庫、軟件、微孔鑒定板組成， 其實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[17]。

1.8 細(xì)菌的基因組DNA提取

采用寶生物工程（大連）有限公司的基因組DNA抽提試劑盒提取。

1.9 16S rDNA 擴(kuò)增與測序

以SNDB5總DNA為模板， 以用DNASTAR軟件分析設(shè)計的引物P1（188bp 左右有一段21bp片斷： 5′CGCTAATACCGCAT ACGTCCT3′）和P2（1 128 bp 左右有1段20 bp片斷： 5′CCATGCAGCACCTGTGTCTG3′） 進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)液為50 μL， 含有ddH2O 40 μL， dNTP 1 μL， 10×buffer 5 μL， TaqE 1μL， 模板DNA 1μL， 50pmol·μL-1 引物2 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min， 94 ℃ 1 min， 53 ℃ 40 s， 72℃ 40 s， 35個循環(huán)， 最后72 ℃保溫6 min。測序由寶生物工程（大連）有限公司完成， 將測序結(jié)果用Blast軟件與Genbank中16S rDNA 序列進(jìn)行同源性比較。

1.10 菌株SNDB5脫氮效能實(shí)驗(yàn)（以下實(shí)驗(yàn)均在好氧條件下進(jìn)行）

將SNDB5以10%的接菌量分別接種到經(jīng)高壓滅菌的同步硝化反硝化培養(yǎng)基和NaNO2模擬廢水中，在15 ℃下，120 r/min 進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)裝置如圖1。每12 h監(jiān)測同步硝化反硝化培養(yǎng)基中NO2--N、NO3--N、菌體生長吸光度（OD600）的變化；硝化培養(yǎng)基及NaNO2 模擬廢水中NO3--N、NO2--N、菌體生長吸光度（OD600）的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

2.1.1 菌株分離純化 經(jīng)過富集分離， 篩選出一株同步硝化反硝化脫氮效果好的菌株SNDB5， 其在肉汁瓊脂平板上生長旺盛， 菌落較大， 呈乳白色。光滑，濕潤，中間隆起，不透明，無核，邊緣整齊。通過革蘭氏染色，鑒定為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡下觀察菌株，發(fā)現(xiàn)該菌均為桿狀菌，大小為（1.5～1.8） μm× （0.4～ 0.6） μm （如圖2所示）。

2.1.2 BIOLOG鑒定結(jié)果 使用Biolog自動菌種鑒定系統(tǒng)對該株菌進(jìn)行鑒定， 該菌株鑒定種屬為Pseudomonas mendocina（如圖3所示）。

2.1.3 SNDB5菌株的16S rDNA基因序列、基因克隆分析 在以16S Forward、16S Internal 和16S Reverse 為引物進(jìn)行DNA 測序時，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果均出現(xiàn)連續(xù)套峰，懷疑是菌種不純所致，因此采取了克隆測序。

質(zhì)粒CTD445XT12測序結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。登陸NCBI網(wǎng)站，將質(zhì)粒進(jìn)行序列比對，分別篩選出10余種與其相似的菌種，利用MEGA4軟件，采取鄰近法對質(zhì)粒構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

將測得的CTD445XT12的16SrDNA 序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，所獲得的同源序列均為Pseudomonas屬的16SrDNA序列。

將CTD445XT12的16SrDNA序列與GenBank中相似的14種已知菌的序列進(jìn)行多序列比對，運(yùn)用MEGA4軟件做出進(jìn)化樹，如圖4所示。

由圖3可知CTD445XT12與EU636659.1（Pseudomonas mendocina）同源性最近，相似性高達(dá)99%。

通過BIOLOG和分子生物學(xué)鑒定，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性，可基本確定分離的菌株為Pseudomonas mendocina。菌株SNDB5與現(xiàn)已報道的好氧同步硝化反硝化菌均不相同。 目前已報道的Pseudomonas mendocina具有反硝化作用，而關(guān)于硝化作用尚無報道。

2.2 菌株SNDB5的硝化作用

以NaNO2 （濃度為0.1 %） 為惟一的氮源，培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min后，取20 mL 放入120 mL 的培養(yǎng)瓶中，菌株活化后接種于該液體培養(yǎng)基中，菌株在以NaNO2為氮源的培養(yǎng)基上生長時，菌體生長曲線及溶液中NO3-濃度的變化曲線如圖5示。由圖4可知，菌體的硝化主要是在菌體的對數(shù)生長期發(fā)生的，而在菌體進(jìn)入衰亡期后，溶液中的NO3-的濃度一直處于很低的濃度水平。碳酸鈉在好氧硝化過程中起著非常重要的作用，它不但作為細(xì)菌Pseudomonas mendocina生長所需的碳源，也是菌株進(jìn)行硝化過程中能量的來源，在C/N 比為2～3時，硝化速率達(dá)到最大[18]。本實(shí)驗(yàn)中C/N 約為16，可能尚未達(dá)到該菌株最佳C/N 比，需要進(jìn)一步研究，以確定此時它的最大硝化速率。

以不同濃度NaNO2（25、50、100、150 mg/L）為惟一的氮源，培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min后，取20 mL 放入120 mL 的培養(yǎng)瓶中，菌株活化后接種于該液體培養(yǎng)基中，菌株在以不同濃度NaNO2為氮源的培養(yǎng)基上生長時，溶液中NO2-濃度的變化曲線如圖6示。由圖6可知，菌株SNDB5在亞硝酸鹽負(fù)荷為50 mg/L時，亞硝酸鹽去除效率最高為66%。在亞硝酸鹽負(fù)荷為25 mg/L時，亞硝酸鹽去除率只有19%。當(dāng)亞硝酸鹽負(fù)荷大于50 mg/L時，亞硝酸鹽去除率隨之下降，在亞硝酸鹽負(fù)荷為100 mg/L時，亞硝酸鹽去除率為64%，亞硝酸鹽負(fù)荷為150 mg/L時，亞硝酸鹽去除率為48%。

隨著亞硝酸鹽負(fù)荷的提高，亞硝酸鹽去除率降低，可以推斷出隨著水中的亞硝酸鹽的濃度加大，菌株SNDB5的活性受到了抑制。3 結(jié) 語

1）分離的菌株SNDB5經(jīng)鑒定為Pseudomonas mendocina，它與目前所報道的好氧硝化反硝化菌均不相同，表明了自然界中好氧硝化反硝化菌的生物多樣性，對揭示好氧硝化反硝化菌群的生態(tài)學(xué)有重要的意義。

2）菌株SNDB5能分別適應(yīng)不同的亞硝酸鹽濃度，當(dāng)亞硝酸鹽負(fù)荷大于50 mg/L時，亞硝酸鹽去除率隨之下降，在亞硝酸鹽負(fù)荷為100 mg/L時，亞硝酸鹽去除率為64%，亞硝酸鹽負(fù)荷為150 mg/L時，亞硝酸鹽去除率為48%。 使得該菌株適應(yīng)力較強(qiáng)，可能存在于含有高氮素濃度的活性污泥中，有應(yīng)用于污水好氧硝化反硝化脫氮處理的潛力。隨著亞硝酸鹽負(fù)荷的提高，菌株SNDB5的活性受到了抑制。

3）低溫條件下硝化反硝化脫氮菌的分離成功為后續(xù)高效工程菌的構(gòu)建及工程應(yīng)用研究提供了理論支撐和前提條件， 使低溫地區(qū)污水處理廠在冬季運(yùn)行時提高脫氮率成為可能。

參考文獻(xiàn)：

[1]Blum D J W，Speece R E.A database of chemical toxicity to environmental bacteria and its use in interspecies comparisions and correlations[J].Research Journal of the Water Pollution Control Federation，1991，63（3）：198207.

[2]Ding A Z，F(xiàn)u J M，Sheng G Y.Evidence of aerobic denitrification[J].Chinese Science Bulletin，2000，45（3）：27792782.

[3]Xie S G，Zhang X J，Wang Z S.Integrated study on biochemical mechanism in biofilter system[J].Acta Scientiae Circumstantiae，2002，22（5）：557561.

[4]Robertson L A，Kuenen J G.Aerobic denitrification： a controversy revived[J].Archives of Microbiology，1984，139：351354.

[5]Sckalk O J，Kuenen J G.Hydeoxylamine oxidation and subsequent nitrous oxide production by the heterotrophic ammonia oxidizer a lcaligenes faecalis[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1999，51（2）：255261.

[6]Robertson L A，van Niel E W J，Torremans R A M，et al.Simultaneous nitrification and denitrification in aerobic chemostst cultures of Thiosphaera pantotropha[J].Applied and Environmental Microbiology，1988，54：28122818.

[7]Lukow T，Diekmann H.Aerobic denitrification by a newly isolated heterotrophic bacterium strain TL1[J].Biotechnology Letters，1997，11（19）：11571159.

[8]張光亞，方柏山，閔航，等.好氧同時硝化反硝化菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2005，11（2）：226228.

ZHANG Guangya，F(xiàn)ANG Baishan，MIN Hang，et al.Identification and phylogenetic analysis of an isolated aerobic simultaneous nitrifierdenitrifier[J].Chinese Journal of Applied and Environmental Biology，2005，11（2）：226228.

[9]胡寶蘭，鄭平，徐向陽，等.一株反硝化細(xì)菌的鑒定及其厭氧氨氧化能力的證明[J].中國科學(xué)C輯：生命科學(xué)，2006，36（6）：493499.

HU Baolan，ZHENG Ping，XU Xiangyang，et al.Identification of a denitrifying bacterium and the anaerobic ammonia oxidation proof of ability[J].Science in China Series C：Life Sciences，2006，36（6）：493499.

[10]Artan N，Wilderer P， Orhon D，et al.The mechanism and design of sequencing batch reactor systems for nutrient removal the state of the art[J].Water Science and Technology，2001，43（3）：5360.

[11]Pochana K，Keller J.Study of factors affecting simultaneous nitrification and denitrification（SND）[J].Water Science and Technology，1999，39（6）：6168.

[12]周德慶.微生物學(xué)教程[M].北京：高等教育出版社，1993.

[13]國家環(huán)保總局.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002.

[14]Halling S B， Hjuler H.Simultaneous nitrification and denitrification with and upflow fixed bed reactor applying clinoptilolite as media[J].Water Treatment，1992，7：7788.

[15]中國科學(xué)院微生物研究所.菌種保藏手冊[M].北京：科學(xué)出版社，1980：293294.

[16]Buchanan R E，Gibbons N E.Bergey’s manual of determinative bacteriology[M].8th ed.Baltimore：Williams and Wilikins Company，1974.

[17]李運(yùn)，盛慧，趙榮華.Biolog微生物鑒定系統(tǒng)在菌種鑒定中的應(yīng)用[J].釀酒科技，2005，7：8485.

LI Yun，SHENG Hui，ZHAO Ronghua.Utilization of biolog microbes identification system in the identification of microbial species[J].Liquormaking Science Technology，2005，7：8485.

[18]Huang H K，Tseng S K.Nitrate reduction by Citrobacter diversus under aerobic environment[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2001，55：9094.

（編輯 王秀玲）doi：10.3969/j.issn.16744764.2012.05.023