富含血小板血漿對組織工程脂肪移植效果的影響

[摘要]目的：在移植的組織工程脂肪組織中加入含激活劑的富含血小板血漿（PRP）或不含激活劑的富含血小板血漿，通過觀察脂肪組織各個時間段的成活率來證明PRP的作用。方法：根據Landesberg二次制備法制備PRP。按1000U凝血酶溶于1ml質量百分比為 10％的CaCl2配制激活劑。從兔背部取脂肪組織制備好，按實驗分組分別加入不同的成分移植到兔子耳部。分別在術后1月、3月、6月測量體積變化。結果：含激活劑的PRP加入組織工程脂肪移植后3個時間段的體積成活率均高于對照組。結論：加入激活劑的PRP釋放生長因子增多，釋放速度增加，間接促進了脂肪干細胞分裂、分化、成活，促進了移植脂肪組織的更新，使脂肪移植成活率增加。

[關鍵詞]脂肪移植；富含血小板血漿；激活劑；組織工程

[中圖分類號]R318 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）02-0250-03

The effects of platelet-rich plasma (PRP) upon the fat tissue after grafts

LINGHU Da-ke1，ZHANG Hai-xia3，TAN Xin-ying1，LI Long1，YANG Yong1，YANG Tao1，LIU Yan-pu1，LIU Bin2

(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Qindu Hospital，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032， Shaanxi， China;2.Department of Oral Biology and Laboratory Animal Center， Qindu Hospital， School of Stomatology， Fourth Military Medical University;3. The 451st Hospital of PLA)

Abstract: Objective To explore the PRP's role in adipose tissue transplantation by detecting the survival rate of adipose tissue at each time point. Methods PRP was prepared according to the method of Landesberg.The activator was made up of l000U bovine thrombin and 1ml 10％ calcium chloride solution. The fat tissues taken from the rabbit back were grafted to the rabbit ears in different experimental groups. The volume changes were measured after 1 month，3 months，6 months，respectively. Results After transplantation，the survival rates of the group within the activator at each time were higher than the group without the activator. Conclusion The activator promoted the the survival rate of transplanted adipose tissue. The reason was that the PRP with the activator released more growth factors，which contributed to adipose stem cells' division，differentiation，and survival.

Key words:fat grafts;platelet-rich plasma;activator;tissue engineering

近年來，軟組織缺損的治療隨著科學技術的發展而出現了許多新的技術，脂肪移植就是其中比較重要的技術[1]，但單純的脂肪組織移植卻有著很不穩定的吸收率，甚至可以高達90%。組織工程的出現，為脂肪移植提供了新的思路，我們課題組針對此進行了自體脂肪顆粒(adipose granu1e，AG）復合血管基質成分(stromal vascular fraction cells，SVF）移植的實驗[2]，雖然取得了一定的效果，明顯提高了脂肪組織的成活率，但卻不是很理想。而生長因子又是組織工程中不可缺少的重要組成部分，隨著研究的深入，決定利用富含血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）作為一種重要的生長因子提供途徑，改善移植脂肪所處的微環境，期望達到更好的效果。而對于富含血小板血漿（PRP）的制備方法許多學者有著不同的意見，其中對于是否需要加入激活劑亦存在許多爭議。本實驗旨在通過在組織工程脂肪移植的過程中復合PRP（含有或者不含有激活劑）來觀察PRP對于移植脂肪組織的成活率的影響，以期對臨床有幫助作用。

1 材料和方法

1.1 材料：5月齡新西蘭大白兔（第四軍醫大學實驗動物中心），手術器械及鋪巾、包布，3%戊巴比妥鈉，Ⅰ型膠原酶（sigma），枸櫞酸鈉溶液，凝血酶，CaCl2（sigma），離心管，注射器，輸液針頭。動物飼養及手術過程均在第四軍醫大學口腔醫院實驗動物中心完成。

1.2 方法

1.2.1 PRP的制備：用注射器抽取1.5ml枸櫞酸鈉溶液，安上輸液針頭，從兔耳的中心動脈抽血，抽到10ml，充分混勻，放置10min。采用Landesberg法二次離心制得PRP[3]。第一次200×g離心15min，取上2層相對澄清液體，取到交界面下3mm，二次離心（200×g，15min），棄掉上清液，即大概上3/4液體。按分組向需要的組中中加入激活劑（凝血酶和CaCl2混合物），液體變為凝膠狀，放入4℃冰箱保存以備移植時制備復合物。

1.2.2 脂肪顆粒（AG）的制備：從兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉兔子，常規對兔的頸背部皮膚備皮消毒，切開，取淺層脂肪組織，縫合傷口。將切取的脂肪剔除大部分筋膜，剪碎，加入PBS，離心（800r/min，3min），取中間層比較純凈的脂肪，用注射器按每只耳朵2ml的量抽取以備移植。

1.2.3 血管基質成分（SVF）復合物的制備：按每只耳朵加入6ml脂肪顆粒消化離心后得到的血管基質成分提取脂肪組織，并將這些脂肪組織按1：1的比例加入Ⅰ型膠原酶在37℃恒溫搖床上震蕩45min。消化液離心10min（1000r/min），倒掉上層液體，底部為血管基質成分，用移液槍將血管基質成分（SVF）吸取出來以備移植。

1.2.4 脂肪移植實驗：以耳中動脈上下分叉上1/4點處為圓心，1.5cm為半徑畫圓，將圓圈范圍內的皮膚和皮下剝離[4]。本實驗分四組，分別為AG， AG+SVF， AG+SVF+PRP（不加激活劑）， AG+SVF+PRP（加激活劑）。將制備好的成分按各自組合混勻，以每個受區內2.5ml的移植量注射入耳內，縫合創口。

1.3 結果體積測量：分別在1月，3月，6月對兔子耳朵移植的脂肪進行測量，用電子游標卡尺測量其長度、寬度和厚度（減去兔子耳朵固有厚度），按體積=長度×寬度×厚度×0.5[5]的公式計算各時間點體積，各個時間點的成活率=各時間點體積/原始體積。

1.4 統計方法：采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，計量資料以x±s表示，不同組間，不同觀察時段用方差分析，兩組間比較采用LSD法t檢驗，以a＜0.05為檢驗水準，對不同組間的差別進行比較。

2 結果

2.1 加入PRP對脂肪移植成活率的影響：4組脂肪的平均成活率如表1所示，采用LSD法t檢驗，P均小于0.05，視為顯著差異。結果表示在脂肪顆粒和血管基質成分的混合物中加入PRP對提高脂肪組織的成活率有顯著的效果。

2.2激活劑對脂肪組織移植復合物成活率的影響：4組脂肪各個時間點的成活率詳細如表1所示，從圖1的成活率曲線[6]中我們可以看出在加B、C、D組在加入血管基質成分后（SVF）后，成活率有所增加。經LSD法t檢驗，1個月時，A組和B組比較P>0.05，無統計學意義。3個月時，A組和B組比較P<0.05，有統計學意義。6個月時，A組和B組比較P<0.05，有統計學意義，說明SVF對于脂肪組織的成活有一定的作用。1個月時，A組和C組比較P<0.05，有統計學意義。3個月時，A組和C組比較P<0.05，有統計學意義。6個月時，A組和C組比較P<0.05，有統計學意義。1個月時，A組和D組比較P<0.05，有統計學意義。3個月時，A組和D組比較P<0.05，有統計學意義。6個月時，A組和D組比較P<0.05，有統計學意義。A組和C組、D組比較說明了PRP和SVF復合后對脂肪顆粒的成活起到了明顯的作用。1個月時，B組和C組比較P>0.05，無統計學意義。B組和D組比較P﹤0.05，有統計學意義。3個月時，B組和C組、D組比較P均小于0.05，有統計學意義。6個月時，B組和C組、D組比較P均小于0.05，有統計學意義，可以認為PRP對脂肪組織復合成分的成活有著顯著的作用。實驗結果表明富含血小板血漿（PRP）可以提高移植脂肪的成活率。1個月時，C組和D組比較P>0.05，無統計學意義。3個月時，C組和D組比較P<0.05，有統計學意義。6個月時，C組和D組比較P<0.05，有統計學意義。可以認為加入激活劑增加了脂肪組織復合物的成活。

3 討論

3.1 在臨床上，先天發育不足、半側顏面萎縮、外傷、畸形、腫瘤術后等常見疾病都會造成頜面部的軟組織缺損，對患者的身體和心理都造成嚴重的影響。而臨床上對于這類常見疾病的治療卻很難達到比較好的效果。

3.2 目前，對于比較復雜的軟組織的缺損和畸形，修復的時候常采用血管化軟組織瓣的方法，雖然對于面部的對稱等都能起到比較好的臨床效果，但這種手術方法具有的這顯著的缺點：手術的創傷比較大，需要從其他部位取得皮瓣；術中需要吻合血管，技術難度高；充填量的準確度無法精確控制。鑒于這種方法的缺點，臨床上出現了新的技術和方法，主要有生物材料充填和自體脂肪注射。生物材料充填存在這生物相容性的免疫排斥問題，這就大大提高了其應用于臨床的難度和成本，使得其適應癥也變得相應的比較窄。1986年Illouz 首先在臨床上使用了自體脂肪注射這種技術，有效的解決了以前技術上創傷大，技術難，可控性小的難題。德國醫生Hoehnke在2007年的時候通過計算機預測設計使的脂肪充填的量得到了更為精確的數值。但現在仍然存在的最大問題是充填脂肪的吸收問題，一般充填的脂肪組織在6個月的成活率只有70%～30%[7]，只能通過多次注射來確保充填的組織量。這樣就增加了手術的次數。經過一部分學者的研究發現，主要影響吸收的問題是成熟脂肪細胞無法再生，并對缺氧的耐受力很低，而受區的微血管的建立非常緩慢，移植脂肪的血供無法滿足，導致脂肪組織的吸收[8]。

3.3 隨著組織工程的出現和發展，越來越多的學者投入到其中，逐漸在體外構建了多種組織，如骨、皮膚、軟骨等。Rigotti 等人對20例因腫瘤放療后胸壁慢性損傷，退行性變的病人。通過脂肪干細胞的治療，使得變性的組織恢復了正常的結構。這些臨床應用并沒有將脂肪干細胞單獨分離出來，而是直接應用含有多種細胞成分的基質血管成分（stromal vascular fraction cells，SVF），所有的患者均有明顯的改善[9]。SVF是血管基質成分，其通過脂肪組織的離心分離得到，其中至少10%為脂肪干細胞[10]。含有多種生長因子、細胞，對移植脂肪組織提供了成活必須的生長因子、血供等，其中含有的脂肪干細胞可分裂、增殖、分化。Yoshimura等人的研究則表明細胞輔助的抽吸脂肪移植術是軟組織重建中一種有效地方法[11]。而生長因子是組織工程中很重要的一個環節，經研究表明，富含血小板血漿（PRP）中含有多種生長因子，如VEGF、PDGF、EGF、TGF-Β等多種生長因子，其中VEGF可以促進脂肪干細胞的增殖及向血管內皮細胞分化，Swennen等將自體PRP用于牽張成骨的動物實驗中，結果顯示PRP對骨愈合有促進作用。這些生長因子將有利于移植的脂肪組織在受區的氧供和血供，以保證脂肪細胞的成活率和更新。

3.4 本實驗采用在移植的組織工程脂肪復合體（AG+SVF）中加入或者不加入PRP來觀察其1個月、3個月、6個月的脂肪組織成活率的變化。經研究表明含有PRP的實驗組可以明顯增加移植脂肪組織的成活率，其效果優于不加PRP組，推測與PRP中含有多種生長因子有關，SVF提供脂肪干細胞等多種細胞，富含血小板血漿（PRP）中含有FGF、TGF-β、VEGF、PDGF、EGF等多種生長因子[12]，這些生長因子可以給脂肪干細胞提供微環境促進脂肪干細胞的分裂增殖、分化，并促進血管內皮細胞的增殖和聚集，這些都為脂肪顆粒的成活與更新起到了關鍵的作用，加快了微血管的形成，使脂肪顆粒得到了更新，降低了其吸收率。而加入激活劑的PRP組脂肪組織吸收率明顯減少說明富含血小板血漿（PRP）加入激活劑以后使其因子釋放的水平增加，更好的促進了血管基質成分（SVF）中的脂肪干細胞、血管內皮細胞等的增殖、分化，生長因子釋放數量增加，增加了脂肪細胞的成活率及更新速率，使得總體脂肪體積吸收減少，此推論與國外相關實驗結果相一致。但具體生長因子釋放的總量和含有生長因子的量仍不清楚，需要進一步研究。

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[收稿日期]2011-09-16 [修回日期]2011-11-24

編輯/張惠娟