水蛭素對瘢痕成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶作用的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：探討水蛭素對體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達(dá)水平的影響。方法：取10例燒傷愈合后6個月內(nèi)瘢痕攣縮需手術(shù)治療的患者的瘢痕組織，采用組織塊法分離培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞。取第4～7代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，加入0、1、10、50U/ml的水蛭素干預(yù)。觀察加藥后24h、48h成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，利用MTT（四甲基偶氮唑藍(lán)）比色法及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測水蛭素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（hypertrophic scar fibroblast，HSFB）及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9）的作用。結(jié)果：①1、10、50U/ml組水蛭素對HSFB均有抑制作用（P<0.05），以50U/ml作用最明顯（24h、48h抑制率分別為14.75%、15.42%）；②水蛭素作用成纖維細(xì)胞24h后 MMP-2、MMP-9表達(dá)含量均增加，分別以1U/ml、50U/ml作用最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；48h后MMP-2表達(dá)降低，MMP-9表達(dá)有增加但無意義。結(jié)論：水蛭素能夠抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，能促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2，MMP-9）有利于細(xì)胞外基質(zhì)降解減少沉積。

[關(guān)鍵詞]水蛭素；增生性瘢痕；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）

[中圖分類號]R282.74 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）02-0247-03

Effect of Hirudin on Matrix Metalloproteinases of Human Hypertrophic Scar Fibroblast

LI Kai-tong，LIU Da-en，LI Shun-tang，LU Hai-qiang，CHEN Xiao-ting，GAO Xing-xin

(Department of Burns and Plastic Surgery， The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， Guangxi，China)

Abstract: Objective To explore the effect of hirudin on the expression of matrix metalloproteinases of the human hypertrophic scar fibroblast. Methods 10 cases of hypertrophic scar tissue were taken from the operated patients who were within 6 months after injury . Fibroblasts of hypertrophic scar tissue were cultured by tissue block method. The cells after 4～7generations were used in experiments， which were interfered with exposure to 0U/ml，1U/ml，10U/ml or 50U/ml hirudin for 24 and 48 hours. We detected the effect of hirudin on the proliferation of fibroblasts by MTT method and the expression of MMP-2，MMP-9 by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results ①Hirudin could inhibit the proliferation of scar fibroblasts in the group of 1，10，50U/ml(P<0.05).The effect of inhibition of hirudin with 50U/ml was most significant(the inhibition rates of 24，48hours were 14.75% and 15.42%). ②The level of expression of MMP-2 and MMP-9 was increased with the role of hirudin on fibroblasts after 24h，especially it was most significant with 1U/ml and 50U/ml.The difference was statistically significant (P<0.05).After 48hours the expression of MMP-2 was decreased，meanwhile the expression of MMP-9 was increased but no significance. Conclusion Hirudin can inhibit the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts，promote the secretion of matrix metalloproteinases (MMP-2， MMP-9) by hypertrophic scar fibroblasts and will help to promote the degradation and reduction of the extracellular matrix.

Key words:hirudin;hypertrophic scar;matrix metalloproteinases

皮膚損傷尤其是深度燒傷愈合后出現(xiàn)的增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）不但影響美觀，嚴(yán)重者還可造成局部畸形或功能障礙。但增生性瘢痕形成機(jī)理尚不完全清楚，目前研究多認(rèn)為是成纖維細(xì)胞（Fibroblast，F(xiàn)B）過度增殖與細(xì)胞外基質(zhì)降解不足所致。而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶系，其中MMP-2、MMP-9逐漸成為研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)中藥治療增生性瘢痕表現(xiàn)出廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)選取體外培養(yǎng)并傳代4～7代的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（HSFB），加入0、1、10、50U/ml的水蛭素，通過觀察不同時相點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，ELISA檢測MMP-2，MMP-9表達(dá)水平變化研究水蛭素對MMP-2、MMP-9的作用，進(jìn)而探討其對增生性瘢痕作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集：標(biāo)本取自2011年5～7月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科進(jìn)行手術(shù)切除的10例增生性瘢痕患者組織標(biāo)本（13塊），其中男性6例，女性4例；年齡4～24（14±7.4）歲；面頸部6例，上肢3例，下肢1例。患者均無基礎(chǔ)疾病、結(jié)締組織疾病或影響組織代謝的疾病；傷后6月內(nèi)未使用過類固醇激素類藥物、抗腫瘤藥物及抑制瘢痕藥物；臨床表現(xiàn)瘢痕處于增生活躍期，外觀充血發(fā)紅，質(zhì)硬，瘢痕增生局限于皮損區(qū)內(nèi)，伴有瘙癢或疼痛。所有操作符合醫(yī)學(xué)倫理道德委員會的要求并取得患者同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及器械：DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所），磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京中杉金橋生物科技公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（北京索萊寶科技有限公司），水蛭素（武漢圣天宇科技有限公司），MMP-2/MMP-9ELISA檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司），全自動酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)：采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。將手術(shù)切取的瘢痕組織在無菌條件下清洗后剪成1mm3的小塊，置入培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿平底70%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)所用為第4～7代細(xì)胞。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)：實(shí)驗(yàn)按照水蛭素濃度分為四組：對照組（0U/ml）；1U/ml組；10U/ml組；50U/ml組。每組6孔，對照組每孔加入無血清DMEM培養(yǎng)液200ul，其余各組每孔加入含對應(yīng)濃度水蛭素的DMEM培養(yǎng)液200ul。各濃度組又分為24h組、48h組。

1.3.3 MTT檢測細(xì)胞增殖活性：加入水蛭素作用24h、48h后加入5mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)4h后加入150ul DMSO（二甲基亞砜），酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm處測量OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.4 ELISA測定MMP-2，MMP-9表達(dá)水平變化：采用雙抗體夾心ELISA法測定各組標(biāo)本MMP-2、MMP-9的表達(dá)含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀在450nm處測定樣品OD值，根據(jù)樣品吸光度值計算出樣品濃度。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：組織塊培養(yǎng)5～7天后可見細(xì)胞從組織塊周圍爬出并開始貼壁生長，細(xì)胞呈梭形，胞體飽滿，扁平長突起狀，多呈平行排列并有一定弧度。細(xì)胞中央可見到圓形或卵圓形細(xì)胞核，細(xì)胞周圍可見到2～3個突起。

2.2 水蛭素作用前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：水蛭素作用24h，倒置相差顯微鏡觀察見HSFB呈平行極性排列，形態(tài)較規(guī)則，可見扁平而長的突起，數(shù)量開始減少。作用48h部分細(xì)胞開始變圓，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞數(shù)量減少明顯，細(xì)胞間接觸減少。

2.3 水蛭素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞活力及增殖的影響：表1顯示水蛭素對HSFB的增殖有抑制作用。隨著藥物濃度增加，抑制呈增加趨勢，50U/ml組抑制作用最明顯。

2.4 ELISA法測定水蛭素作用HSFB分泌MMP-2，MMP-9表達(dá)變化：水蛭素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分泌MMP-2的影響見表2，水蛭素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞分泌MMP-9的影響見表3。由表2可見：水蛭素作用24h后檢測到細(xì)胞中MMP-2表達(dá)水平呈增加趨勢，1、10、50（U/ml）組中MMP-2的濃度均高于對照組（1765.5pg/ml）中的濃度，且1U/ml組中表達(dá)含量達(dá)最高水平（4988pg/ml），與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而48h后MMP-2含量呈下降趨勢，以10、50（U/ml）組的減少較明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。由表3可見：作用24h后隨著藥物濃度的增加MMP-9表達(dá)含量呈增加趨勢，以50U/ml組含量最高（273.83pg/ml），與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。48h組MMP-9表達(dá)含量較24h組明顯升高，但各濃度組與對照組比較差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

3.1 水蛭，俗稱螞蝗，是一味傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》謂其：水蛭味咸平，主逐惡血、瘀血、月閉，中醫(yī)認(rèn)為有破血、逐瘀、通經(jīng)功能。1955年德國人Markwardt F[1]首次從醫(yī)用水蛭中成功分離出水蛭素，1970年被證明為凝血酶的特異性抑制劑。水蛭素是目前已知的高效、特異、活性最強(qiáng)的凝血酶抑制劑，由65個氨基酸殘基組成單鏈多肽，分子量約為7000，能與凝血酶直接結(jié)合，抑制凝血酶活性而產(chǎn)生抗凝作用。與肝素[2]相比，水蛭素抗凝活性更強(qiáng)，且用量少不會引起出血，也不依賴于內(nèi)源性輔助因子，是一類很有應(yīng)用前景的抗凝藥。目前臨床上廣泛應(yīng)用于心血管內(nèi)科，腎內(nèi)科，燒傷整形外科等領(lǐng)域。近年來研究發(fā)現(xiàn)水蛭素有抑制細(xì)胞增殖作用，Ogiichi T等[3]將水蛭素作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞證實(shí)水蛭素能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增生，鄭燕林[4]等將水蛭素作用于兔增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變模型后發(fā)現(xiàn)水蛭素能夠抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，楊影等[5]證實(shí)其對體外培養(yǎng)的鞏膜成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)有抑制作用。

3.2 增生性瘢痕是皮膚真皮損傷尤其是深度燒傷后創(chuàng)面修復(fù)異常所致的病理性結(jié)構(gòu)，目前研究多認(rèn)為是以成纖維細(xì)胞過度增殖為主的細(xì)胞外基質(zhì)大量合成、降解不足及大量細(xì)胞因子產(chǎn)生所致[6]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一族含有九種甚至更多的具有很高同源性的含鋅或其他金屬離子的內(nèi)源性多肽酶。在已經(jīng)了解的MMPs中MMP-2（又稱明膠酶A）和MMP-9（又稱明膠酶B）是膠原及基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，共同的酶底物主要是IV型膠原，此外MMP-2還可以降解V、VII型膠原、彈性蛋白、纖維粘連蛋白等。MMP-2和MMP-9分布在瘢痕組織的各層，前者以成纖維細(xì)胞周圍的染色最明顯，與瘢痕組織早期的細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝關(guān)系密切；后者主要表達(dá)于表皮細(xì)胞中，出現(xiàn)在創(chuàng)面愈合的早期。兩者與其抑制因子關(guān)系的失衡是促進(jìn)創(chuàng)面過度修復(fù)形成瘢痕的關(guān)鍵因素。瘢痕增生早期，MMP-2分泌增加促進(jìn)基質(zhì)分解，利于成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞遷移能促進(jìn)創(chuàng)面愈合。章伏生等[7]研究發(fā)現(xiàn)3～6月瘢痕組織和6～12月瘢痕組織中MMP-2表達(dá)均較正常皮膚增高，而3～6月瘢痕組織的MMP-2又顯著高于6～12月瘢痕組織的MMP-2，亦說明在早期瘢痕中表達(dá)更明顯。隨著成纖維細(xì)胞遷移、增殖，引起MMP-2等的抑制因子產(chǎn)生增加，超過MMP-2和MMP-9表達(dá)含量的增加，導(dǎo)致二者關(guān)系失衡引起細(xì)胞外基質(zhì)合成分解代謝失衡，致使細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積。

3.3 本實(shí)驗(yàn)收集增生性瘢痕標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)，在體外構(gòu)建增生性瘢痕成纖維細(xì)胞培養(yǎng)模型，通過MTT測定細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)水蛭素對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用，作用24h即開始抑制細(xì)胞生長。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度水蛭素作用后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9表達(dá)含量較對照組增加，以1U/ml濃度對二者表達(dá)含量影響作用最明顯，能夠促進(jìn)二者表達(dá)含量的升高，說明水蛭素對MMP-2和MMP-9表達(dá)有促進(jìn)作用。我們認(rèn)為水蛭素對增生性瘢痕的抑制作用機(jī)制一方面可能是抑制成纖維細(xì)胞的增殖，另一方面是能夠促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，增加酶含量促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，因而能夠減輕瘢痕增生。實(shí)驗(yàn)為今后進(jìn)一步研究水蛭素對增生性瘢痕作用機(jī)制提供了思路。

3.4 在增生性瘢痕發(fā)生和轉(zhuǎn)歸過程中MMP-2，MMP-9和其抑制因子起著重要的調(diào)節(jié)作用。李璇[8]等研究發(fā)現(xiàn)水蛭素能夠通過減少膠原產(chǎn)生來抑制增生性瘢痕，張奇等[9]通過免疫組化及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)水蛭素能通過增加Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)而抑制HSFB。郭睿等[10]研究發(fā)現(xiàn)水蛭素通過下調(diào)成纖維細(xì)胞分泌TGF 1，上調(diào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的分泌而抑制增生性瘢痕的形成。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了水蛭素能夠抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，對基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2，MMP-9）有促進(jìn)表達(dá)作用，因此水蛭素應(yīng)用治療增生性瘢痕有著廣闊的應(yīng)用前景，其具體機(jī)制和劑型有待進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2011-09-12 [修回日期]2011-11-25

編輯/張惠娟