miR-200c對TGF-β1刺激后人瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原合成的影響

[摘要]目的：觀察轉染miR-200c mimics 對人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKFs）膠原蛋白分泌的影響。方法：將miR-200c mimics用oligofectami脂質體轉染人瘢痕疙瘩成纖維細胞后，3H-脯氨酸摻入法測加入 50μg／L劑量的轉化生長因子(TGF-β1) 刺激前后膠原蛋白水平的變化。結果：轉染miR-200c mimics后，膠原蛋白分泌水平降為正常皮膚成纖維細胞表達水平；經TGF-β1刺激后，其蛋白水平仍無明顯變化。結論：miR-200c可明顯抑制人瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原蛋白分泌，推測其機制是通過抑制TGF-β1生物學作用。

[關鍵詞]miR-200c；人瘢痕疙瘩成纖維細胞；膠原蛋白；轉化生長因子-β1

[中圖分類號]R619+.6 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）02-0242-03

Effect of miR-200c on collagen secretion in TGF-β1-stimulated human keloid fibroblasts

MENG Xi-yong

(Department of Plastic Surgery，No.421 Hospital of Chinese PLA， Guangzhou 510318，Guangdong，China)

Abstract: Objective To investigate the effect of miR-200c mimics on collagen secretion in human keloid fibroblasts(HKFs). Methods miR-200c mimics were transfected by oligofectami package. The collagen level was measured by 3H-proline incorporation method before and after HKFs were stimulated by transforming growth factor betal (TGF-β1) of the dosage of 50μg/L. Results The collagen level was decreased to the normal skin fibroblasts level and had no obvious change even after stimulated by TGF-β1. Conclusion miR-200c can inhibit the expression of collagen in HKFs.The mechanisms may be inhibit the biological effects of TGF-β1.

Key words:miR-200c;human keloid fibroblasts;collagen;TGF-β1

瘢痕疙瘩是皮膚損傷如創傷、燒傷或手術后引發的以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征的過度瘢痕化，其發病機制目前仍不明確，但公認為其是多種因素共同作用的結果。轉化生長因子β1(transforming growth factor betal，TGF-β1)是已知的與瘢痕疙瘩形成關系最為密切、最具代表性的細胞因子，它的異常表達會促進病理性瘢痕的形成[1]。MicroRNA(miRNA)是一種小非編碼RNA，通過調節基因表達影響多種生物學行為，包括細胞增殖、凋亡和分化[2-3]。miRNAs與瘢痕的研究報道較少，但已有大量報道表明miRNAs與多種皮膚病有密切關系[4]。例如miR-200家族在皮膚黑素瘤細胞的侵襲模式和形態差別均起不同的調節作用[5]。已證實miR-200c能夠對抗并逆轉TGF-β1誘導出現的上皮-間質轉化[6]，并且miR-200c在瘢痕疙瘩組織中表達比正常組織的低6.92倍[7]，基于此，本研究旨在探討在人瘢痕疙瘩成纖維細胞（HKFs）中過表達miR-200c能否對抗TGF-β1誘導膠原蛋白分泌的作用，為瘢痕疙瘩的基因治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料：TaKaRa總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；熒光標記FAM-miR-200c mimics及其nagetive control、miR-200c特異性 qRT-PCR檢測試劑盒（SYBR Green法，含人miR-200c特異性引物和U6內參）購自上海吉瑪公司，TGF-β1購自美國Santa Cruz公司；胎牛血清、RPMI1640培養基及oligofectami脂質體購自Invitrogen公司；胰酶購自南京凱基公司。

1.2 實驗方法：人瘢痕疙瘩成纖維細胞的培養：取整形手術中切下的瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織在無菌條件下經漂洗，消毒，剪碎成0.5cm×0.5cm大小的組織塊，接種于培養瓶內，置37℃，50ml/L CO2中培養箱中培養4h，再加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中繼續培養。每周換液2次，待原代培養細胞近融合時經胰酶消化傳代。所用細胞為第3～5代。實驗分6組：①正常皮膚成纖維細胞組，簡稱正常組；②HKFs不加任何處理因素，簡稱空白組；③HKFs轉染negative control，簡稱nc組；④HKFs轉染 FAM-miR-200c mimics，簡稱mimics組；⑤HKFs+50μg/L TGF-β1，簡稱TGF-β1組；⑥HKFs+50μg/L TGF-β1+FAM-miR-200c mimics（簡稱混合組）：作用24h后將FAM-miR-200c轉染至HKFs。細胞轉染方法按照說明書進行，negative control及mimics用量為說明書推薦的中間用量。

1.3 miR-200c轉染效率檢測：轉染后每隔12h于熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度和密度，在熒光強度和密度最強時提取nc組和mimics組細胞總RNA，經逆轉錄后熒光定量PCR檢測miR-200c的表達效率，操作按說明書進行，每組重復3次實驗。

1.4 3H-脯氨酸摻入法測成纖維細胞膠原蛋白合成：細胞l×104/孔分別種于24孔培養板上，處理36h后吸棄上清液，加入3H-脯氨酸繼續培養10h，多孔收集器收集細胞于玻璃纖維紙上，液閃測定儀閃爍記數測定3H-脯氨酸摻入量。每組設3個復孔。

1.5 統計學分析：采用SPSS13.0軟件，miR-200c轉染效率數據用兩獨立樣本t檢驗，各組膠原蛋白數據比較用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 miR-200c轉染效率檢測結果：轉染36h熒光密度和強度最大（圖1），熒光定量PCR檢測顯示轉染36h，mimics組的miR-200c表達量是nc組的15.48倍（圖2），證明在HKFs中過表達miR-200c成功。

2.2 miR-200c對HKFs膠原合成的作用：正常組、空白組、nc組、mimics組、TGF-β1組及混合組的3H-脯氨酸摻入率分別如表1所示，HKFs的膠原合成明顯比正常皮膚成纖維細胞強（t=-13.963，P=0.000）；miR-200c作用HKFs后，膠原合成與正常皮膚成纖維細胞無明顯差異（t=1.426，P=0.227），TGF-β1可以明顯增加成纖維細胞膠原的合成(t=-10.875，P=0.000)；而miR-200c對TGF-β1刺激后的HKFs膠原合成有明顯抑制作用(t=20.326，P=0.000)，膠原合成降為正常皮膚成纖維細胞表達水平。

3 討論

3.1 瘢痕疙瘩又稱蟹足腫，是一種生長較為活躍，極少進入成熟期的瘢痕組織，表現為皮膚在創傷后成纖維細胞活性的異常增高，大量結締組織沉積而導致瘢痕過度增生，超出原有損害范圍，常嚴重損害患者容貌外觀，并伴有癢痛，影響生活質量。瘢痕疙瘩在臨床常見且治療頗為棘手，迄今為止尚無有效的方法。目前研究提示瘢痕的形成與成纖維細胞對TGF-β1的敏感性增加密切相關，抑制TGF-β1的生物學作用可降低成纖維細胞增殖，有助于改善瘢痕的形成，對瘢痕的治療有一定的指導作用[8]。

3.2 miRNAs是一類長度大約22個核苷酸（nt）的単鏈非編碼RNA大家族，它由DNA轉錄產生，但并不翻譯蛋白質，而是在蛋白質合成中起調節其他基因的功能，是調控其他蛋白質編碼基因的基因。隨著miRNAs在不同生物中的大量發現，對miRNAs功能的研究越來越引起人們的重視，已經成為近年來的研究熱點。已有大量報道表明miRNAs與多種皮膚病有密切關系[4]，但miRNA s在瘢痕疙瘩病理形成中的機制目前仍然缺少報道。miR-200c屬于miRNA-200家族一員（miRNA-200家族包括miR-141，miR-200a， miR-200b， miR-200c， miR-429），miRNA-200家族與腫瘤的侵襲、轉移甚至腫瘤干細胞均有密切關系。研究表明miR-200c在瘢痕疙瘩組織中的表達比正常組織明顯降低，它的表達失調可能與瘢痕疙瘩的形成有密切關系[7]。而在系膜細胞中上調miR-200c可以影響誘導TGF-β1[9]，且已證實miR-200c能夠對抗并逆轉TGF-β1誘導出現的上皮-間質轉化[6]，說明miR-200c能影響TGF-β信號通路進而觸發一系列生物學改變。

3.3 本實驗在HKFs轉染miR-200c的mimics從而使HKFs恢復miR-200c的表達，通過熒光定量PCR檢測顯示轉染成功。通過3H-脯氨酸摻入法測各組成纖維細胞膠原蛋白合成變化，發現miR-200c能顯著抑制HKFs膠原合成，經統計與正常皮膚成纖維細胞膠原合成無差異，且在TGF-β1刺激下膠原水平仍無明顯變化，提示miR-200c可以明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的膠原合成，根據已有研究及結合本實驗結果推測其機制至少是miR-200c通過抑制TGF-β1的生物學作用而實現，但由于一個miRNAs可以調控數十乃至上千個基因，故其中牽涉到的分子生物學機制尚待進一步研究。

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[收稿日期]2011-09-13 [修回日期]2011-11-19

編輯/張惠娟