利用IRAP技術揭示部分柿屬種間遺傳關系

摘要： 【目的】為了明晰柿屬植物種間親緣關系和探究逆轉座子與該屬植物倍性進化的相關性，【方法】以16種24份柿屬植物為試材，利用IRAP（Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism）技術和UPGMA聚類分析。【結果】采自我國南熱帶的供試基因型獨自成組，與其采集地域相吻合，反映了它們較古老的分類學地位；采自我國北亞熱帶和溫帶的基因型獨立于南亞熱帶基因型組，含豐富的染色體倍性，且相互間混聚在一起，無明顯地域趨同性，反映了該區域基因型間廣泛的基因交流和適應性進化；從UPGMA聚類圖反映的不同區域柿屬基因型間的相對位置來看，逆轉座子活性與其倍性進化及生態適應性間存在明顯的相關性。【結論】采自我國南亞熱帶的柿屬植物可能更加古老；逆轉座子在柿屬種間倍性進化過程中可能發揮了一定的作用。

關鍵詞： 柿屬植物； 遺傳關系； IRAP； 逆轉座子

中圖分類號：Ｓ６６5．2 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－1004－０6

柿屬（Diospyros L.；2n=2x，4x，6x，9x=30，60，90， 135）植物約400~500種[1]，主要分布于熱帶、亞熱帶地區。溫帶分布的柿（D. kaki Thunb.；2n=6x，9x=90，135）是該屬作為果樹栽培的代表種，經濟價值最高，但其起源與進化途徑尚不清楚。前人已對柿與柿屬近緣種間的親緣關系進行過研究[2-4]，但取材范圍狹窄（以國外分布的種為主），且主要以保守的單拷貝基因序列為主，信息量有限。

逆轉座子是高等植物基因組的重要組成部分，以復制－轉座的方式影響植物基因組的倍性、多樣性及遺傳適應性。Kalendar等[5]開發的逆轉座子間擴增多態性(inter-retrotransposon amplified polymorphism，IRAP） 技術，揭示基因組中逆轉座子之間序列的多態性，比SSR、AFLP等分子標記操作簡單；較基因測序成本低廉；與RAPD、ISSR等常規分子標記相比，試驗重復性好、檢測位點數多且多態性豐富；與其他逆轉座子分子標記如RBIP、SSAP和REMAP比較，操作步驟簡化、靈敏度更高，近年在植物種質資源研究上應用廣泛[6-10]。Guo等[11]和Du等[12-13]基于自主開發的柿特異逆轉座子引物開發出柿屬IRAP分子標記，成功用于該屬植物的部分基因型親緣關系分析，但所用試材側重種下基因型。

逆轉座子在植物基因組進化中發揮重要作用，IRAP是檢測逆轉座子基因組轉座行為的有效手段。我們擬利用IRAP技術對分布于我國不同地理區域的不同染色體倍性的柿屬植物進行研究，期望從逆轉座子角度揭示柿屬植物種間親緣關系及其可能的起源進化途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 葉片總DNA提取采用CTAB法[14]。

2 結果與分析

2.1 擴增產物多態性分析

2.2 聚類分析

采用UPGMA法進行聚類分析，將聚類結果進一步轉化為協表征矩陣，對協表征矩陣和相似系數矩陣的相關性進行Mantel 檢驗。結果表明，2種矩陣極顯著相關，相關系數為0.950，表明聚類結果很好的體現了種質間的遺傳關系。

3 討 論

3.1 IRAP用于柿屬植物遺傳關系分析結果的可靠性

研究中‘君遷子’（通常作為柿的砧木）與‘油柿’（通常由于提取柿單寧）與柿的親緣關系較近；浙江柿2、‘浙江柿1’和‘君遷子’聚在一起，并且與柿的親緣關系較近，與Guo等[16]的研究結果一致；

Nakamura等[17]、Yonemori 等[3]的研究表明‘老鴉柿’與柿的親緣關系最遠，本研究中‘老鴉柿’聚在了第2組的次外圍，支持他們的結論；‘烏柿’和‘老鴉柿’均可用作柿樹的砧木，‘老鴉柿’標本過去常被誤定為‘烏柿’，2者除果柄長度、果的宿存萼裂片形狀及葉形存在差異外，其他植物學特征十分相似；‘苗山柿’近似‘嶺南柿’，2者均系小喬木，葉革質，橢圓形，先端漸尖、基部鈍或近圓形，葉柄略纖細，果為球形，初時密被粗伏毛，后變無毛。本研究中，上述2類試材都各自成組，表明聚類結果所反映的種質間的遺傳關系與植物學特征基本吻合；此外，部分已知親緣關系的試材，如芽變、日本柿及中國柿種質各自單獨聚類，與其實際親緣關系相符，表明本研究基于IRAP技術獲得的柿屬植物種間和柿種下遺傳關系的可靠性。

3.2 IRAP揭示的柿屬植物種間遺傳關系

Yonemori 等[3-4]分別應用cpDNA PCR-RFLP和ITS及matK基因測序分析柿屬植物種間親緣關系，表明供試的亞熱帶和溫帶柿屬材料聚類結果與地理分布無明顯趨同性。本研究除云南（南亞熱帶）采集的5份柿屬種質外，其他13個種（北亞熱帶和溫帶采集）都表現相對較近的親緣關系而相互混聚在一起，分支與地理分布相關性小，同Yonemori 等[3]結果類似，說明柿屬植物的起源可能較早，在先于現有種的地理分布之前柿種間幾個主要的分類群已經形成。而處于南亞熱帶地區的云南被認為是柿屬植物的起源地之一，本研究在該地區采集的幾份柿種獨自成組，反映了他們更為古老的分類學地位。

在南亞熱帶采集的基因型中，除野毛柿外的其他4個種在形態學上明顯與柿存在差異，它們在聚類圖上呈現的聚類結果也驗證了這一點，初步可以認為其與柿的親緣關系較遠。但野毛柿的聚類結果與實際不太相符：該種質在外觀形態上與柿相似程度很高[18]，國內的分類中甚至將其與柿種及柿的變種野柿劃歸為一類，Yonemori 等[18]也將其暫定為柿種的候選祖先種之一。而我們的聚類圖上，其與柿種以及其他幾個既定的與柿親緣關系較近的近緣種的關系卻甚遠，推測其可能系栽培柿的中間祖先種或更加古老的祖先種。

3.3 IRAP揭示的逆轉座子與柿屬植物倍性進化關系

逆轉座子具有逆境激活特性，環境、氣候、加倍化、雜交等因子可誘導轉座事件發生[19-20]。本研究中采自南亞熱帶的試材均是2倍體，而供試溫帶柿屬植物存在2倍體、4倍體，6倍體和9倍體等廣泛的染色體倍性多樣性。逆轉座子間擴增多態性分析結果通過聚類圖顯示：北亞熱帶地區的試材與采自南亞熱帶云南西雙版納的試材染色體倍性變化同氣候帶的逐步過渡呈現一定規律性，即隨氣候帶順序從中國南部的南亞熱帶―北亞熱帶―溫帶過渡，分布的柿屬植物染色體倍性逐漸增加，表明逆轉座子通過發生逆境激活轉座可能參與了柿屬植物的倍性進化過程。進一步的證據和相關機理研究還需通過從逆轉座子拷貝數、基因組分布與柿屬植物倍性間的關系角度展開。

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