柑橘黃龍病LAMP快速檢測方法的建立及應用

摘要：【目的】為了建立柑橘黃龍病菌亞洲種LAMP快速檢測方法。【方法】根據黃龍病菌亞洲種外膜蛋白基因，在種屬特異保守區域的6個位點設計2對特異性引物，對反應條件和體系進行優化，并通過產物沉淀觀察和SYBR Green I熒光染料顯色的方法來快速判讀檢測結果。同時對田間樣品進行了特異性和靈敏度分析試驗。【結果】該方法僅需63 ℃反應70 min即可得到結果，特異性強，靈敏度高。對柑橘常見病害樣品進行LAMP擴增，僅HLB陽性樣品擴增產物電泳呈特征性梯狀條帶。檢測靈敏度比常規PCR高100倍，與實時定量PCR相當。在對105份黃龍病田間疑似樣品檢測中，LAMP陽性檢出率為52.4%，常規PCR為37.1%，2種檢測方法符合率為84.7%。【結論】建立的黃龍病菌亞洲種LAMP檢測方法，快速簡便、特異性強、靈敏度高，為快速檢測柑橘黃龍病提供了新方法和新思路。

關鍵詞： 柑橘黃龍病菌亞洲種； 外膜蛋白基因； 環介導等溫擴增技術

柑橘黃龍病（Citrus Huanglongbing， HLB）是世界柑橘生產上最具毀滅性的病害之一，是國內外植物檢疫對象。目前主要分布在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50個國家和地區，中國19個柑橘生產省（市、自治區）中已有11個受到該病危害，嚴重制約柑橘產業的健康發展。其病原物暫定為α-變形菌綱韌皮部桿菌屬（Candidatus Liberibacter），包括亞洲種（‘Ca. L. asiaticus’）、非洲種（‘Ca. L. africanus’）和美洲種（‘Ca. L. americanus’）[1-2]，在我國該病害主要由亞洲種引起[3]。田間癥狀表現為病樹的黃梢和葉片的斑駁型黃化，果實小，畸形，嚴重影響柑橘的品質與產量。由于目前缺乏有效藥劑和抗病品種，主要采取砍除病樹、防治木虱和種植無病苗木等防控措施，因此加強柑橘黃龍病的早期診斷顯得尤為重要。傳統的指示植物[4]、電鏡[5]和血清學[6]等診斷方法不僅費時費力，而且效率低；近年，常規PCR[7]、巢式PCR [8]和實時定量PCR[9-10]已應用到柑橘黃龍病的檢測上，但是 PCR 檢測技術需要特殊儀器設備且檢測成本較高，不適合在田間大規模快速應用，因此，在加強柑橘苗木檢疫監測中，迫切需要一種成本低廉、操作簡便、結果判斷快速、靈敏度高和特異性強的柑橘黃龍病檢測方法。

日本學者Notomi等[11]于2000年開發了一種新型的恒溫核酸擴增方法，即環介導等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplification， LAMP）。該技術針對靶基因的6個特定區域設計4條特異引物，借助具有鏈置換作用的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在等溫條件下進行靶序列高效擴增。它避免了常規 PCR 溫度循環的特殊要求，因其簡便、高效，成本低、檢測周期短等優點，具有較高的應用價值。LAMP檢測技術已廣泛應用于臨床、食品、農業等領域，目前在植物中主要集中在植物病毒、細菌、真菌性病害及轉基因作物的檢驗檢疫工作中[12-15]，具有較大的開拓空間。因此，我們主要運用LAMP技術，建立一種柑橘黃龍病的快速檢測方法。

1 材料和方法

1.1 供試材料

從我國7省（市、區）收集黃龍病疑似樣品，大部分由中國農業科學院柑桔研究所國家苗木脫毒中心田間調查采集，少量樣品由現代柑橘產業體系綜合試驗站和各地植保植檢系統工作人員提供，所有樣品4 ℃保存備用。潰瘍病、黑星病、炭疽病和褐斑病等柑橘病害的DNA模板在國家苗木脫毒中心實驗室-20 ℃保存。

1.2 主要試劑

Bst DNA聚合酶購自北京紐英倫生物技術有限公司；氯化鉀、硫酸銨和硫酸鎂等購自Sigma公司；10000×SYBR Green I購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；Trans1-T1 Phage Resistant 化學感受態購自北京全式金生物技術有限公司；Ssp I限制性內切酶、DNA標準分子量和PCR相關試劑購自Takara和Promega公司。

1.3 DNA的提取

利用CTAB法提取柑橘葉脈基因組DNA，提取方法參照Murray等[16]方法，樣品-20 ℃保存備用。

1.4 LAMP引物的設計

根據NCBI公布的‘Ca. L. asiaticus’基因組的外膜蛋白基因保守序列（Genbank登錄號：AY842429），利用PrimerExplorer V4在線軟件（http：//primerexplorer.jp/e/）在種屬特異保守區域設計外引物對（F3和B3）和內引物對（FIP和BIP）；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。序列信息見表1。

1.5 LAMP反應體系和反應條件的優化

分別對反應體系（Mg2+、dNTPs、Betaine、omp-FIP/BIP和omp-F3/B3的濃度等）和反應條件（反應溫度和時間）進行優化，每個因子設置3個重復試驗。Mg2+終濃度分別為0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L-1；dNTPs終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L-1；甜菜堿（Betaine）終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1； omp-FIP/BIP終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol·L-1；omp-F3/B3終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol·L-1；反應溫度采用57、59、61、63、65 ℃依次遞增；反應時間分別采用10、20、30、40、50、60、70、80、90 min。在25 μL反應體系中，5×Reaction Buffer[100 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.8、50 mmol·L-1 KCl、50 mmol·L-1 （NH4）2SO4、0.5% Tween 20]、Bst DNA 聚合酶8 U、模板1.0 μL、加ddH2O補足至25 μL，混勻，于65 ℃水浴鍋中反應80 min，之后80 ℃下滅活5 min結束反應，取5 μL 反應產物上樣于2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以確定最佳反應體系和反應條件。

1.6 LAMP特異性檢測及其產物內切酶鑒定

采用優化后的反應體系和反應條件，以柑橘黃龍病、潰瘍病、黑星病、炭疽病、褐斑病及健康樣品DNA為模板，以雙蒸水代替DNA模板作空白對照進行LAMP反應，檢測該方法的特異性。取LAMP 產物4.0 μL，加10×Ssp I Basal Buffer 2.0 μL、Ssp I限制性內切酶1.0 μL、加ddH2O至總體積20 μL，37 ℃ 反應4 h 后取8 μL 酶切產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，經10 g·L-1溴化乙錠（EB）染色后，使用凝膠成像系統觀察結果，LAMP 產物經Ssp I 酶切，理論上酶切產物為70 bp和133 bp。

1.7 LAMP與實時定量PCR和常規PCR靈敏度的比較

將純化的PCR產物直接與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，重組T載體轉化Trans1-T1 Phage Resistant化學感受態，用Plasmid Mini Kit提取重組質粒DNA，核酸濃度測定儀測定其D 260nm/D 280nm值，計算樣本DNA的拷貝數，取1.0 μL提取的質粒DNA，并做10倍梯度稀釋，用于檢測LAMP方法的靈敏度。實時定量PCR和常規PCR的靈敏度試驗均采用LAMP的2條外引物（omp-F3和omp-B3）。25 μL實時定量PCR反應體系為：2×SYBR Premix ExTaqTMⅡ12.5 μL，5 μmol·L-1 omp-F3/B3混合物1.0 μL，模板1.0 μL，加ddH2O補足到25 μL。擴增程序為：95 ℃預變性30 s；PCR反應95 ℃ 5 s，63 ℃ 30 s，40個循環，在63 ℃同步采集熒光；熔解曲線過程為95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，從65 ℃開始每個循環升高0.5 ℃，連續升高60次（到95 ℃為止）。 25 μL 常規PCR反應體系為：10×Buffer 2.5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 2 μL，10 mmol·L-1 dNTPs 0.3 μL，5 μmol·L-1 omp-F3/B3混合物1.0 μL，5 U·μL-1 r Taq DNA聚合酶0.3 μL，模板1.0 μL，加ddH2O補足到25 μL。擴增程序為：95 ℃ 預變性2 min，95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸12 s，35個循環后，72 ℃延伸5 min。預期片段大小為194 bp，取擴增產物6.5 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，經EB染色后，使用凝膠成像系統觀察結果。以上試驗，均設置至少3次重復。

2 結果與分析

2.1 LAMP反應體系和反應條件的優化

2.1.1 反應體系的優化 優化后的反應體系 （25 μL） 確定為：8 mmol·L-1 Mg2+、1.2 mmol·L-1 dNTPs、1.6 μmol·L-1 omp-FIP/BIP、0.2 μmol·L-1 omp-F3/B3、Bst DNA 聚合酶8 U、5×Reaction Buffer，模板DNA 1.0 μL。根據實驗結果，甜菜堿濃度的逐步增加，對擴增結果未見明顯變化，因此確定不需要添加甜菜堿。

2.1.2 反應條件的優化 反應溫度。用優化后的反應體系對反應溫度進行最適選擇，當溫度在57 ℃時，未見梯狀擴增條帶，當溫度在59 ℃、61 ℃、63 ℃和65 ℃時，擴增條帶逐漸變得明亮清晰（圖1）。因此，選擇63 ℃作為LAMP反應的最佳反應溫度。

反應時間。當反應30 min后，開始出現微弱擴增條帶，隨著時間的延長，條帶逐漸明亮清晰，當反應到70 min左右時，能檢測到3.9×101拷貝的質粒DNA模板（圖2）。因此，選擇70 min作為LAMP反應的最佳反應時間。

2.2 LAMP擴增產物的分析

反應結束后，擴增產物可以通過瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜，出現特征性梯狀條帶為陽性，未出現特征性梯狀條帶為陰性（圖版-A）；也可以通過觀察濁度或者短暫離心觀察沉淀，出現白色渾濁或白色沉淀即為陽性，否則為陰性（圖版-B）；若在反應液中加入1000×SYBR Green I顯色液，出現綠色表明為陽性，橙色則表明為陰性（圖版-C）。結果表明，LAMP產物采用瞬時離心觀察焦磷酸鎂白色沉淀和SYBR Green I熒光染料顯色，結果與電泳一致。

2.3 LAMP特異性檢測及其產物內切酶鑒定

以優化的LAMP檢測體系對柑橘黃龍病、潰瘍病、黑星病、炭疽病、褐斑病及健康樣品進行LAMP擴增反應，只有HLB DNA模板有特異性擴增條帶，而其他模板均未見擴增條帶（圖3-A），表明LAMP方法特異性強。LAMP產物經Ssp I限制性內切酶酶切后得到大約70 bp和133 bp的條帶（圖3-B），酶切產物與理論值相符。

2.4 LAMP與實時定量 PCR和常規PCR靈敏度的比較

采用LAMP和實時定量PCR進行檢測時，質粒DNA拷貝數為3.9×101的模板仍可以擴增，而常規PCR在質粒拷貝數為3.9×103時，才得到微弱的擴增條帶（圖版-D～H）。表明LAMP方法與實時定量PCR檢測靈敏度相當，但比常規PCR高100倍。

2.5 田間樣品的應用檢測

應用建立的LAMP方法對105份黃龍病田間疑似樣品進行檢測，并與常規PCR方法比較。結果表明，LAMP檢出55份陽性，陽性率為52.4%，其中有39份用PCR方法檢測也為陽性，陽性率為37.1%，2種檢測方法符合率為84.7%（表2）。

3 討 論

本研究基于外膜蛋白靶基因，建立并優化了柑橘黃龍病菌亞洲種LAMP快速檢測方法。針對本套引物，Mg2+濃度在8 mmol·L-1時反應條帶最佳，與之前文獻報道的Mg2+最佳濃度為8 mmol·L-1相一致[17-18]，引物和dNTPs濃度對反應體系的影響差異不顯著。有報道表明添加甜菜堿有助于保持Bst DNA聚合酶的活性和穩定性，使雙鏈 DNA 處于不穩定狀態，減少堿基的堆積，從而提高 LAMP 擴增效率[11]，因此本研究對LAMP反應體系中甜菜堿的作用和最適濃度作進一步探索，但結果表明該體系不需要添加甜菜堿即可獲得高效擴增。應用建立的LAMP技術對柑橘田間樣品進行擴增，僅HLB樣品為陽性，并對其產物進行酶切鑒定，均表明該方法具有較強的特異性。在靈敏度分析試驗中，該方法最低檢出量為3.9×101拷貝，與實時定量PCR檢測結果一致，但比常規PCR高100倍；在對105份黃龍病田間疑似樣品檢測中，LAMP和常規PCR檢測結果符合率為84.7%，這些差異進一步證明了LAMP的靈敏度要高于常規PCR方法。最近，Mao等[19] 和Li等[20]應用LAMP檢測相關樣品，其靈敏度比常規PCR高10倍或100倍以上。由此可見，在靈敏度上表現差異的原因目前尚不清楚，可能是由于引物的擴增效率，也可能是擴增體系的優化問題，或者是不同研究對象DNA樣品中某些物質抑制了反應的高效擴增，因此，對優化反應體系和反應條件最佳因子的選擇不可一概而論。

Okuda等[21]于2005年在黃龍病菌亞洲種的nus G-rplKAJL-rpoB基因簇區和16S rDNA基因區設計了兩組引物，其中以16S rDNA基因區為靶基因的引物擴增產生非特異性條帶，因此應用nusG-rplKAJL-rpoB基因簇區建立了黃龍病菌亞洲種的LAMP檢測技術，其結果顯示，檢測靈敏度只能檢出近300個基因拷貝，與常規PCR一致。而本研究基于黃龍病菌亞洲種omp基因保守位點設計引物并建立的黃龍病LAMP檢測方法，靈敏度明顯比其高出一個數量級，并且對反應體系和反應條件相關因子進行了優化組合，建立了更加靈敏特異的檢測技術。這種差異的產生，極大可能是由于引物的設計及體系優化所致，因此，對引物，特別是內引物的長度、內引物之間的距離、二級結構、G+C含量、Tm值等都要有嚴格的要求，盡可能接近引物設計理論值。設計高擴增效率的引物，利于提高LAMP檢測病菌的靈敏度。該方法與常規PCR相比較，從DNA抽提到結果的判斷，僅約1.5 h，大大縮短了檢測時間。LAMP反應結束后，直接短暫離心觀察焦磷酸鎂白色沉淀[17，22]或添加熒光染料SYBR Green I于可見光或紫外光下觀察顏色變化[13，23-24]，可不通過電泳直接快速判讀結果，特別適合普通實驗室及現場的大批量樣品檢測。

4 結 論

研究建立的柑橘黃龍病LAMP快速檢測技術，特異性強、靈敏度高、方便簡捷、成本低廉，無需電泳及特殊儀器設備，特別適合田間樣品快速檢測。為柑橘黃龍病的檢測提供了新的思路，有望成為簡易的常規檢測手段。（本文圖版見插3）

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