蘋果栽培品種SSR指紋圖譜的構建

摘要：【目的】通過構建蘋果栽培品種的SSR標記指紋圖譜數據庫，以實現對蘋果品種的快速、準確鑒定。【方法】以國內外40個主要栽培品種為試驗材料，選用均勻分布于17條染色體上的144對SSR引物進行PCR擴增并采用6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與SSR熒光標記毛細管電泳相結合的方法進行檢測。【結果】結果表明，從144對SSR引物中篩選出了35對多態性較高、譜帶清晰的引物，35對引物共檢測到314個等位基因，每對SSR引物擴增出等位基因數3～15個，平均8.97個；多態性信息含量指數（PIC）變化為0.455 3～0.834 6，平均為0.692 0；各個位點的雜合度在0.475 0～1.000 0，平均為0.794 3；標記系數（MI）平均為6.208 0，其中CH04c10引物對蘋果基因組DNA變異檢測最有效，其多態性信息含量指數和標記指數均最高，分別為0.834 6和12.519 0。 以CH03d07、NZ02b1和CH05c04這3對引物進行組合鑒定，即可將40個蘋果品種完全區分開。與6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法相比，熒光標記毛細管電泳檢測能更準確讀出目標片段的大小，檢測效果更為理想，更適合于DNA指紋圖譜數據庫的建立。【結論】將2種檢測方法結合構建蘋果品種DNA指紋圖譜，結果更準確、更可靠。

關鍵詞：蘋果； SSR標記； 熒光標記； 指紋圖譜

中圖分類號：Ｓ６６1．1 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－971－０7

DNA指紋圖譜具有多位點性、高變異性和簡單穩定的遺傳性，因而自其誕生就引起了人們的重視，表現出巨大的實用價值[1]。國內外對于利用DNA指紋圖譜數據庫進行品種鑒定極為重視。英國、德國、荷蘭、法國、西班牙等五國于1997年啟動了一項利用簡單重復序列（SSR）標記技術進行小麥、西紅柿等主要作物品種鑒定的項目，制定了統一的利用分子標記技術進行品種鑒定的方法標準[2]。北京農林科學院玉米研究中心已建成了基于SSR標記技術的玉米指紋圖譜數據庫[3]，包含的玉米品種數量已達5 000余份。國際植物新品種保護聯盟（UPOV）已將SSR標記技術和單核苷酸多態性技術（SNP）推薦為適合構建指紋圖譜數據庫的2種技術，認為SSR標記技術是目前最為成熟的技術[4]。

目前建立作物的SSR指紋圖譜的方法多采用瓊脂糖、普通聚丙烯酰胺凝膠、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、TP-M13-SSR技術[5-6]和常規熒光SSR技術。從分辨率上看，非變性聚丙烯酰胺凝膠均不能分辨大小在2個堿基對以內的差異，瓊脂糖凝膠分辨率更低；而變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結合放射自顯影、銀染等手段能夠分辨最小為1個堿基對的差異，能夠分辨同一SSR位點上的不同等位基因，完全滿足構建指紋圖譜數據庫對等位基因大小分辨率的要求。基于DNA測序儀的SSR熒光標記毛細管電泳檢測方法可以得到定量的DNA片段分析數據，與常規的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法相比，毛細管電泳檢測結果更為精確、靈敏、高效，更適用于大批量品種的檢測分析[7]。因此利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測與SSR熒光標記毛細管電泳檢測方法相結合的方法進行蘋果品種DNA指紋鑒定，方法可行、結果可靠[8]。

蘋果屬種質資源豐富、種類多、分布廣，且利用歷史悠久，在果樹栽培、生產和育種上經濟價值很高[9-10]。隨著果樹育種技術的不斷發展，新培育出的蘋果栽培品種越來越多，保證品種的真實性、維護生產者與育種家的權益顯得日趨重要。而蘋果多用無性繁殖，樹體基因型高度雜合，極易造成同物異名或同名異物現象，鑒別起來較困難。以往對品種鑒別主要靠形態指標，但對于差異并不明顯的個體，傳統的形態特征很難識別，而利用SSR分子標記對品種進行鑒定和分類[11-12]，是一種簡單準確而且可靠的方法。因此構建蘋果SSR指紋圖譜數據庫對蘋果品種鑒別具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.5 電泳數據分析 使用Genemapper4.0軟件收集原始數據，再利用Power Marker V3.25對供試材料進行分析。最后將2種方法獲得的等位基因數據進行統計，對比與分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增體系與引物退火溫度

2.2 核心引物的篩選及SSR多態性

選用均勻分布在蘋果17條染色體上的144對SSR引物，利用8份蘋果材料進行PCR擴增及電泳檢測，并對PCR擴增體系與引物退火溫度進行優化，篩選出35對多態性高、譜帶清晰的引物。然后利用這35對引物對40份材料擴增，分別進行6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測與SSR熒光標記毛細管電泳檢測，對數據進行統計分析后得到40份材料在35個位點的數據（表3）35對引物共檢測到314個等位基因，每對SSR引物擴增出等位基因數3~15個，平均8.97個；多態性信息含量指數 （PIC）變化為0.455 3~0.834 6，平均為0.692 0；各個位點的雜合度在0.475 0~1.000 0，平均為0.794 3；標記系數（MI）平均為6.208 0，其中CH04c10引物對蘋果基因組DNA變異檢測最有效，其多態性信息含量指數和標記指數均最高，分別為0.834 6和12.519 0。在所選35對引物中PIC＞0.5的高度多態性信息引物33對，0.25＜PIC＜0.5的中度多態性信息引物2對（CH01f09， 0.4622; Hi03e03， 0.455 3）。

2.3 指紋圖譜分析

2.4 多重毛細管電泳檢測與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測對比

3 討 論

從研究蘋果指紋圖譜PCR擴增體系的優化過程可知SSR對反應體系要求非常嚴格，尤其是對蘋果這種高度雜合的物種，在反應體系中引物和Mg2+2種成分含量變化對擴增條帶影響較大[13-15]，引物、Mg2+濃度增加均會導致大量非特異性條帶的出現，而基于SSR方法所建立的指紋圖譜要求所擴增的條帶穩定性與特異性高，因此對PCR反應體系的優化是完成指紋圖譜建立的前提。本研究通過大量實驗探索出一套穩定適用于蘋果SSR擴增的體系與程序，為后續工作的進行奠定了基礎。

選擇合適的引物是構建蘋果分子指紋圖譜的另一重要前提[16-17]，本研究選取的144對SSR引物均勻位于蘋果17對染色體上。在144對SSR引物進行多次篩選的基礎上，篩選出35對多態性高、重復性好的引物進行圖譜構建。從數據分析中發現，不同的引物對品種間多態性的鑒別能力有較大差異，無任何一個引物可以完全區分40個品種。而將35個核心引物分別進行合理的3~4對引物組合后發現，每個組合可以將所有供試材料區分開，因此通過不同引物的有限組合，可以大大提高引物的鑒別能力。而隨著品種數量的進一步增加，引物的組合基數便進一步加大，而世界上的蘋果栽培品種有幾千種，對于所有的蘋果主栽品種或出現新品種時，難免會出現同一引物在不同品種間出現相同譜帶的現象，此時應采用不同的核心引物組合或者篩選新的SSR引物將其區分開，以補充和擴展現已建立的初步指紋圖譜。

在采用SSR聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法構建蘋果品種DNA數據庫的工作中，如何準確地整合不同批次、不同膠塊的蘋果品種DNA指紋鑒定數據一直是個難題[18]。為了保證蘋果品種DNA指紋圖譜方法的可行性與結果的可靠性，本研究采用了6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法與SSR標記毛細管電泳檢測方法相結合進行驗證，結果證明2種方法檢測到的等位基因數目和各實驗材料對應的等位基因類型基本一致，而個別品種經2種方法檢測到的等位基因數目存在差異主要是由于熒光標記毛細管電泳檢測與常規的凝膠電泳檢測方法相比，數據更為精確所致。

參考文獻 References:

[1] WANG Zhuang-wei， ZHAO Mi-zhen， YUAN Ji， WU Wei-min， QIAN Ya-ming. Establishment of SSR fingerprinting database for 38 cultivars of strawberry （Fragaria ananassa） native to Europe and America[J]. Journal of Fruit Science， 2011， 28（6）: 1032-1037.

王壯偉， 趙密珍， 袁驥， 吳偉民， 錢亞明. 38個歐美草莓栽培品種SSR指紋圖譜的構建[J]. 果樹學報， 2011， 28（6）: 1032-1037.

[2] DONG Yu，ZHANG Wei，YUAN Jian-xia，ZHAO Ya-juan，ZHANG Bo，LEI Xiao-ping，LI Chao，WANG Xiao-mei，HAN Tao. The international development trend analysis of crop molecular design breeding.[Publication is unknown]，2009，[http://ir.las.ac.cn/handle/12502/2838]

董瑜，張薇，袁建霞，趙亞娟，張博，雷孝平，李超，王曉梅，韓濤.作物分子設計育種的國際發展態勢分析[OL/J]. 2009，[http://ir.las.ac.cn/handle/12502/2838]

[3] WANG Feng-ge， ZHAO Jiu-ran， GUO Jing-lun， LIU Long-zhou. Series of research on establishing DNA fingerprinting pool of chinese new maize cultivars: I．The establishment of a standard SSR system fitting for maize cultivars identification[J]． Journal of Maize Science， 2003， 11（1）: 3-6.

王鳳格， 趙久然， 郭景倫， 劉龍洲. 中國玉米新品種DNA庫建立系列研究: I．玉米品種純度及真偽鑒定中SSR標準實驗體系的建立[J]. 玉米科學， 2003， 11（1）: 3-6.

[4] GAO Hua， DNA fingerprinting and genetic diversity in apple cultivars[D]. Yangling: Northwest AF University，2010.

高華. 蘋果栽培品種的DNA指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析[D]. 楊凌: 西北農林科技大學， 2010.

[5] GAO Yuan， WANG Kun， TIAN Lu-ming， CAO Yu-fen， LIU Feng-zhi. Identification of apple cultivars by TP-M13-SSR technique[J]．Journal of Fruit Science， 2010， 27（5）: 833-837.

高源， 王昆， 田路明， 曹玉芬， 劉鳳之. 應用TP-M13-SSR 技術鑒定蘋果品種[J]. 果樹學報， 2010， 27（5）: 833-837.

[6] GAO Yuan， WANG Kun， TIAN Lu-ming， CAO Yu-fen， LIU Feng-zhi. TP-M13-SSR technique and its applications in analysis of genetic diversity for apple germplasm resources[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2011， 12（2）: 228-233.

高源， 王昆， 田路明， 曹玉芬， 劉鳳之. TP-M13-SSR技術及其在蘋果種質資源遺傳多樣性研究中的應用[J]. 植物遺傳資源學報， 2011， 12（ 2）: 228-233.

[7] HAO Chen-yang， WANG Lan-fen， JIA Ji-zeng， DONG Yu-shen， ZHANG Xue-yong. Comparison of fluorescence and silver-staining detection systems of microsatellite markers[J]. Acta Agronomica Ainica， 2005 ，31（2）: 144-149.

郝晨陽， 王蘭芬， 賈繼增， 董玉琛， 張學勇. SSR標記和銀染技術的比較分析[J]. 作物學報， 2005， 31（2）: 144-149.

[8] TAKEZAKI N， NEI M. Genetic distances and reconstruction of phylogenetic trees from microsatellite DNA[J]. Genetics，1996，144: 389 -399.

[9] GAO Yuan， LIU Feng-zhi， CAO Yu-fen， WANG Kun. Analysis of genetic relationship for Malus germplasm resources by SSR Markers[J]. Journal of Fruit Science， 2007， 24（2）: 129-134.

高源， 劉鳳之， 曹玉芬，王昆．蘋果屬種質資源親緣關系的SSR分析[J]. 果樹學報， 2007， 24（2）: 129-134.

[10] WANG Ai-de， LI Tian-zhong， XU Xue-feng， HAN Zhen-hai. SSR analysis for apple cultivars[J]． Acta Horticulturae Sinica， 2005， 32（5）: 875-877.

王愛德， 李天忠， 許雪峰， 韓振海．蘋果品種的SSR分析[J]. 園藝學報， 2005， 32（5）: 875-877.

[11] TAUTZ D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers [J]. Nucleic Acids Research，1989，17（16）: 6463-6471.

[12] GUIFORD P， PRAKASH S， ZHU J M，RIKKERINK E，GARDINER S，BASSETT H，FORSTER R. Microsatellites in Malus × domestica （apple）: abundance， polymorphism and cultivar identification[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1997，94: 249-254.

[13] LUIS G， CRISTINA M， OLIVEIRA. Molecular characterization of cultivars of apple （Malus × domestica Borkh.） using microsatellite（SSR and ISSR） markers[J]. Euphytica， 2001， 122: 81-89.

[14] CAI Qing， JIANG Li-jie， ZHANG Xiao-ming， YAN Guo-hua， ZHANG Kai-chun， CAO Yu-fen， MA Huan-pu. Identification of apple varieties with SSR molecular markers[J]．Chinese Agricultural Science Bulletin， 2007（7）: 129-134.

蔡青， 姜立杰， 張曉明， 閆國華， 張開春， 曹玉芬， 馬煥普. 蘋果主栽品種的SSR分子標記鑒別[J]. 中國農學通報， 2007（7）: 129-134.

[15] LIEBHARD R， GIANFRANCESCHI L， KOLLER B， RYDER C D， TARCHINI R， VAN DE， WEG E， GESSLER C. Development and characterisation of 140 new microsatellites in apple （Malus × domestica Borkh．）[J]. Molecular Breeding， 2002， 10: 217-241.

[16] CHEN Chen， ZHANG Xing-tao， CHENG Fei， ZHUANG Mu， LIU Yu-mei， YANG Li-mei， ZHANG Yang-yong， FANG Zhi-yuan．Establishment of SSR fingerprinting on autumn cabbage hybrids and their parents[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2011， 38（1）: 159-164.

陳琛， 張興桃， 程斐， 莊木， 劉玉梅， 楊麗梅， 張揚勇， 方智遠. 秋甘藍品種的SSR指紋圖譜的構建[J]. 園藝學報， 2011，38（1）: 159-164.

[17] AI Cheng-xiang， QIN Zhi-hua， TAO Ji-han， WANG Chang-jun. SSR fingerprints and genetic variations of the 32 persimmon major cultivars[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2011， 31（11）: 2185-2191.

艾呈祥， 秦志華， 陶吉寒， 王長君. 32個柿主栽品種SSR構建及遺傳變異分析[J]． 西北植物學報， 2011， 31（11）: 2185-2191.

[18] CHENG Ben-yi， XIA Jun-hui， GONG Jun-yi， YANG Shi-hua. Application of capillary electrophoresis detection with fluorescent SSR markers in rice DNA fingerprint identification[J]． China Journal Rice Science， 2011， 25（6）: 672-676.

程本義， 夏俊輝， 龔俊義， 楊仕華. SSR熒光標記毛細管電泳檢測法在水稻DNA指紋鑒定中的應用[J]. 中國水稻科學， 2011， 25（6）: 672-676.