蘋果實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選

摘要： 【目的】為篩選蘋果實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中最適內(nèi)參基因，【方法】應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析5個(gè)傳統(tǒng)內(nèi)參基因18SrRNA、ACTB、GAPDH、UBQ、TUB在蘋果不同基因型、不同組織、果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)差異情況。供試的6個(gè)不同基因型蘋果分別為：新疆野生蘋果、八棱海棠、麗江山荊子、‘津輕’、‘國(guó)慶’、‘金冠’；6種不同組織為果皮、果肉、葉片、愈傷組織、花瓣、種子；5個(gè)果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期為花后28、50、74、95、115 d?！窘Y(jié)果】經(jīng)geNorm 程序分析發(fā)現(xiàn)5 種內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性各異，UBQ在果實(shí)不同基因型和不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)分析中最穩(wěn)定； ACTB和UBQ在6種不同組織中表達(dá)均穩(wěn)定?！窘Y(jié)論】UBQ在參試樣品中表達(dá)均比較穩(wěn)定，是研究蘋果基因表達(dá)分析中理想的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞： 蘋果； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR； 內(nèi)參基因； geNorm程序

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2012？雪06-965-06

近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time Fluorescence Quantitative PCR， RT-qPCR）技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)物種基因表達(dá)的絕對(duì)定量和相對(duì)定量研究中。與傳統(tǒng)的RNA定量技術(shù)相比，RT-qPCR對(duì)于低拷貝數(shù)的mRNA具有更靈敏的探測(cè)能力[1]，在相對(duì)定量檢測(cè)中，為了比較不同樣本mRNA表達(dá)量水平，要求不同樣本之間起始細(xì)胞數(shù)目相同，RNA提取效率相同，且目的基因的擴(kuò)增效率相同，但這些條件不可能同時(shí)滿足，導(dǎo)致基因表達(dá)差異比較大[2]。為了避免不同樣本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量、逆轉(zhuǎn)錄效率以及擴(kuò)增效率上可能存在的差別， 通常利用內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)校正和標(biāo)準(zhǔn)化[3]。

理想化的內(nèi)參基因應(yīng)在各種類型的組織、細(xì)胞和各種實(shí)驗(yàn)因素條件下均能恒定表達(dá)。然而，大量的研究結(jié)果表明，并沒(méi)有表達(dá)絕對(duì)穩(wěn)定的基因，任何一種管家基因的所謂恒定表達(dá)都只是在一定類型的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)因素作用下“有范圍”的恒定[3]。隨著對(duì)定量要求的不斷提高， 為了得到更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 實(shí)驗(yàn)中需要選擇較為合適的1個(gè)或多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正。

GeNorm（http：//medgen.ugent.be/wjvdesomp/genorm/）是基于Excel程序開(kāi)發(fā)出用于評(píng)價(jià)內(nèi)參基因穩(wěn)定性和變異系數(shù)的軟件，該軟件程序首先將某一內(nèi)參基因與其他內(nèi)參基因表達(dá)水平進(jìn)行兩兩比較和對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，獲得其平均標(biāo)準(zhǔn)差，而后將該平均標(biāo)準(zhǔn)差作為基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值M，再對(duì)所有候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析結(jié)果判定所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目[4]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.4 數(shù)據(jù)處理和分析 將各組織的cDNA稀釋液作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)模板，反應(yīng)體系和條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)體系。將得到的Ct值數(shù)據(jù)輸入geNorm程序運(yùn)行，該程序能夠計(jì)算出每個(gè)候選基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值M，根據(jù)M值的大小對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度進(jìn)行排序（M值越小，表達(dá)就越穩(wěn)定），選出最優(yōu)內(nèi)參基因，同時(shí)通過(guò)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析（Vn/n+1）能夠判定內(nèi)參基因的最適數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

2.2 內(nèi)參基因的PCR分析

2.3 內(nèi)參基因的熒光定量PCR分析

以蘋果不同材料來(lái)源的第1鏈cDNA為模板， 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。分析結(jié)果從表1中列出的5個(gè)候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率及PCR擴(kuò)增效率可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率均大于0.98，顯示出較好的線性關(guān)系；同時(shí)，這5個(gè)內(nèi)參基因也表現(xiàn)出良好的擴(kuò)增效率，說(shuō)明定量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，所用引物可特異性擴(kuò)增DNA序列。從圖3～5可以看出， 5個(gè)內(nèi)參基因在蘋果不同組織中的表達(dá)水平都有一定的變化；其中18SrRNA作為傳統(tǒng)內(nèi)參基因的表達(dá)豐度相對(duì)較高，其表達(dá)量是其他基因的幾倍，GAPDH、UBQ、TUB的Ct值居中，而ACTB表達(dá)豐度則較低。

2.4 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

3 討 論

Xu等[9]在對(duì)楊樹(shù)實(shí)時(shí)定量PCR的9個(gè)內(nèi)參基因的篩選中發(fā)現(xiàn)EF1a和18SrRNA表達(dá)最穩(wěn)定。Yan等[10]在對(duì)柑橘RT-qPCR的7個(gè)內(nèi)參基因的篩選中則發(fā)現(xiàn)18SrRNA， ACTB和rpII表達(dá)最穩(wěn)定。Jain等[11]通過(guò)對(duì)水稻（Oryza sativa）中10個(gè)常用內(nèi)參基因的檢測(cè)， 發(fā)現(xiàn)UBQ5和eEF-1α在不同組織中的表達(dá)比較一致， 18SrRNA和25SrRNA在不同環(huán)境處理下表達(dá)較為穩(wěn)定。Kim等[8]分析了 4個(gè)水稻內(nèi)參基因 （18SrRNA、GAPDH、ACT、TUB ）表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明18SrRNA在不同發(fā)育時(shí)期以及不同品種和紫外傷害下的2組黃化苗中，表達(dá)均最為穩(wěn)定。以上研究均發(fā)現(xiàn)18SrRNA作為內(nèi)參基因表達(dá)最穩(wěn)定，而本文結(jié)果表明18SrRNA雖然在蘋果各個(gè)組織中表達(dá)豐度很高，但其穩(wěn)定性較差，不適合做蘋果不同組織基因表達(dá)的內(nèi)參基因，這與Brunner等[12]的研究結(jié)果一致，即常被用來(lái)作內(nèi)參基因的18SrRNA基因的穩(wěn)定性并不十分理想。原因可能在于18SrRNA在熒光定量PCR中表達(dá)豐度偏高，而目標(biāo)基因豐度較低導(dǎo)致定量結(jié)果準(zhǔn)確性降低；其次，18SrRNA要求反轉(zhuǎn)錄必須使用隨機(jī)引物，但目標(biāo)基因反轉(zhuǎn)錄常使用 oligo dT，這可能會(huì)使2者的反轉(zhuǎn)錄效率不同而影響基因表達(dá)水平的可比性；再者，不同生理狀態(tài)的組織器官中 rRNA與mRNA的比例并不是恒定不變的[13]，其轉(zhuǎn)錄易受到各種生物因素和藥物的影響，導(dǎo)致其表達(dá)水平也并不恒定，例如在有絲分裂期間，18SrRNA明顯減少或停止表達(dá)；最后，RNA的部分降解對(duì)18SrRNA的表達(dá)水平的影響可能要小于對(duì)mRNA的影響[14]。

目前，在龍眼[15]，桃[16]和葡萄[17]等果樹(shù)中已經(jīng)有了關(guān)于內(nèi)參基因穩(wěn)定性篩選的報(bào)道，他們分別篩選出 UBQ、Fe-SOD、TEF2、UBQ10、RP II還有GAPDH， actin，EF1-α等幾個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因。結(jié)合本文研究結(jié)果可以看出，不同內(nèi)參基因在果樹(shù)中穩(wěn)定性各不相同。本文研究的5個(gè)基因?yàn)檠芯枯^多的傳統(tǒng)內(nèi)參基因，均是生物體維持生命活動(dòng)所必需的細(xì)胞器骨架的基本組分或參與生物體的基本生化代謝過(guò)程，其在所有的細(xì)胞和生理狀態(tài)下都能較穩(wěn)定地表達(dá)；ACTB在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂等細(xì)胞生理活動(dòng)方面發(fā)揮著重要的作用；GAPDH是糖酵解和糖異生過(guò)程的關(guān)鍵酶，參與糖酵解過(guò)程中第1個(gè)ATP形成，表達(dá)量較高[18-19]；TUB是生物體維持生命活動(dòng)所必需的細(xì)胞器骨架的基本組分；UBQ則參與生物體的基本生化代謝過(guò)程，是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的蛋白質(zhì)降解調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可以影響或調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)。本文對(duì)以上5個(gè)傳統(tǒng)內(nèi)參基因在蘋果17份不同cDNA材料中的表達(dá)結(jié)果顯示，在研究蘋果不同基因型和蘋果不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)時(shí)，應(yīng)選擇UBQ作為內(nèi)參基因，而研究蘋果不同部位、不同組織的基因表達(dá)時(shí)，內(nèi)參基因應(yīng)首選ACTB。當(dāng)然在追蹤基因表達(dá)的微小變化時(shí)，單獨(dú)使用一個(gè)內(nèi)參基因往往不能得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，這時(shí)可以同時(shí)列出2個(gè)或幾個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行內(nèi)參校正。

在蘋果后基因組時(shí)代，內(nèi)參基因的獲得將不再局限于幾個(gè)傳統(tǒng)基因，而更穩(wěn)定表達(dá)更能廣泛使用的新內(nèi)參基因的獲得除了從大量基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)參基因[20]，還可以像擬南芥（Arabidopsis thaliana）[21]等一些重要模式生物一樣，通過(guò)利用全基因組搜索并經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來(lái)獲取可靠的內(nèi)參基因。

4 結(jié) 論

對(duì)蘋果5個(gè)內(nèi)參基因（18SrRNA、ACTB、GAPDH、 UBQ、TUB）進(jìn)行熒光定量PCR穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明，UBQ在蘋果不同基因型以及果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期中表達(dá)均最穩(wěn)定，ACTB雖然表達(dá)豐度偏低，但是在蘋果不同組織的基因表達(dá)分析中表現(xiàn)最穩(wěn)定。在蘋果不同基因型和蘋果不同組織的基因表達(dá)分析中，不同內(nèi)參基因之間的穩(wěn)定性表現(xiàn)出了較大的差異，而UBQ在前一組材料中表達(dá)穩(wěn)定性最高，在后一組材料中也表現(xiàn)出了僅次于ACTB的穩(wěn)定性，并可以取代其做為蘋果不同組織的最適內(nèi)參基因。

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