宜昌橙體細胞染色體的45SrDNA熒光原位雜交分析

摘要: 【目的】 為了初步探討宜昌橙（Citrus ichangensis Swingle）體細胞染色體聯會發生的機制，【方法】以中國農業科學院國家種質重慶柑橘圃（CRICAAS）提供的宜昌橙為試驗材料，利用熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization， FISH）研究了其體細胞有絲分裂中期染色體上45S rDNA的分布情況，并結合聯會區域比較分析。【結果】結果表明，不同類型宜昌橙細胞分裂中期染色體45SrDNA的分布位點無明顯差異，均存在4個雜交位點，分別位于第2對同源染色體的短臂端部或者近端部，及第9對染色體的次縊痕區域。【結論】宜昌橙體細胞染色體聯會現象并非隨機生物現象，而是宜昌橙固有的細胞學特征；其體細胞染色體聯會以同源染色體聯會為主，推測可能與異染色質集中區域或者結構形成有關。

關鍵詞: 宜昌橙； 體細胞； 染色體聯會； 熒光原位雜交； 異染色質

中圖分類號：Ｓ６６6．4 文獻標志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－985－０5

宜昌橙為（Citrus ichangensis）為蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）常綠果樹，具抗寒性強、耐貧瘠、矮化，且具有適應性廣和抗病性強（尤其是柑橘潰瘍病）特點，是非常寶貴的柑橘種質資源和砧木材料，目前對宜昌橙的研究集中在起源、地理分布、砧木利用以及生理特性方面，而對其細胞學研究則相對較少。

染色體在細胞分裂期配對（chromosome pairing），或者稱聯會（synapsis）往往是生物體形成配子的減數分裂特有現象，是減數分裂的重要特征。Overton[1]和Metz[2]分別于1909和1916年報道了體細胞染色體聯會現象。根據體細胞有絲分裂中期和間期染色體距離的測量結果分析，有學者認為某些動物和植物體細胞中同源染色體位置常常是非隨機的相互靠近，并稱此現象為體細胞同源染色體配對（somatic pairing），也稱為體細胞聯合或者聯會（somatic association or synapsis）[3]。該領域以往的研究多數是停留在染色體相互靠近這一表面現象的描述和統計，關于染色質或者染色體絲的真正連接和可能發生的基因重組和遺傳物質的交換以及聯會的機制方面的研究也只是在少數物種中有所涉及。

前期研究發現宜昌橙是體細胞染色體聯會很好的材料，不僅可清晰的觀察到染色體質或絲之間的連接，且經過初步統計，聯會頻率達27.1%～40.2%，這為進一步深入研究其聯會發生的染色體區域、染色體類型和聯會機制創造了重要前提條件。我們從細胞學角度，利用45S rDNA熒光原位雜交技術（（fluorescence in situ hybridization， FISH）對宜昌橙體細胞有絲分裂中期的染色體進行觀察和研究，分析了45S rDNA在染色體上的分布位點數目和分布區域，初步探討了宜昌橙體細胞染色體聯會發生的機制，為后續進一步的研究提供借鑒和參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.2 45S rDNA-FISH分析 45S rDNA序列質粒由南開大學惠贈，質粒DNA提取采用北京鼎國的質粒快速提取試劑盒，檢測DNA質量用0.8%瓊脂糖凝膠電泳；探針（Roche公司）標記使用地高辛隨機引物延伸法；原位雜交及雜交信號的檢測參照Chen等[5]、Jiang等[6]及Kamstra等[7]的方法，稍作改動。主要包括染色體標本前處理，探針標記，封阻DNA制備，雜交緩沖液配制及雜交，洗脫及信號檢測，鏡檢圖像采集。其中染色體制片襯染試劑為DAPI，所激發的熒光為藍色，抗體結合時均采用Anti-digoxingenin-fluorescein，所激發的熒光為綠色，為了便于圖片分析，將襯染顏色模擬轉換為紅色，因此合成后在信號的區域則顯示為黃綠色。

2 結果與分析

3 討 論

3.1 45SrDNA與宜昌橙體細胞染色體聯會

通過分析45SrDNA在染色體分布的數目和定位的位置，可以很好地用于鑒別染色體，同時在系統發育學和物種親緣關系研究中也是一項很重要的依據。45SrDNA是高度串接重復序列，在基因組上有一對或者幾對染色體具有此位點，在染色體上的物理位置具有一定的固定性，可以為研究基因組在分子和染色體水平上的進化提供線索[10]，可以有效地反映種、屬間的分化程度[11]。通過FISH技術將45SrDNA在染色體上進行定位，可以為核型分析提供有效的細胞學標記，特別對于染色體較小且形態相近的物種[12]，并且對研究基因組間的關系、進化情況以及在基因組內區分染色體類型也具有重要意義[13]。

本文結合熒光原位雜交技術研究了宜昌橙體細胞中期染色體上45SrDNA在宜昌橙體細胞染色體上的分布區域和染色體的聯會進行了比較分析，發現它的分布位點主要是第2對同源染色體的短臂端部或者近端部，及第9對染色體的次縊痕區域。它的分布位點呈現一定的物理位置的固定性。梁國魯等[9]曾對國家果樹種質柑橘圃的60個具有代表性的柑橘屬采用Tanaka的分類系統進行分類發現，宜昌橙的隨體組來自枸櫞的1對縊痕大隨體和柚的1個大隨體。這與梁國魯等[9]的研究結果呈現出一致性。

3.2 宜昌橙體細胞染色體聯會可能的機制

體細胞染色體聯會現象發生的機制，國內外學者的研究報道中尚未形成定論。有學者認為是化學藥劑對有絲分裂中期染色體的排列有影響，如秋水仙素，8-羥基喹啉、溴代萘、放線菌酮能增加某些染色體間的距離，而氯霉素則有促進體細胞染色體聯會的作用。Avivi等[14]發現秋水仙堿對普通小麥具端著絲粒同源染色體聯會現象具抑制作用，在預處理時間相同情況下，著絲粒間的平均距離隨處理液濃度的增加而增加。他們認為秋水仙堿破壞了紡錘絲微管蛋白的形成，而抑制同源染色體聯會。Singh等[15]在證明了小麥——黑麥體細胞染色體聯會現象的同時，也認為化學藥物對染色體的預處理并不影響同源染色體的配對。還有學者認為同源染色體的聯會現象是一種環境效應，并非生物體固有特性。Ravindran[16]用不同的培養基培養虎眼萬年青（Ornithogalun virens），發現根尖細胞同源染色體的聯會是些土壤因子后效應，pH值則可能使核蛋白的離子發生變化，導致某些染色體緊密連接。但戴灼華等[17]持相反意見，他發現不同地區金色果蠅近緣種品系腦神經節細胞的同源染色體有規律地聯會，并認為是果蠅物種的固有特性，而非人為或者化學藥物的作用。

也有學者認為是異染色質區段相互吸引并黏合的結果。Ashley[18]對O. virens 花粉生殖核及根細胞染色體的研究發現，經C帶技術處理后，未顯帶的非同源染色體端粒間仍發生聯會。有研究表明，染色體聯會與間期染色中心有關，而染色中心與中期染色體的結構異染色質一致[19]。所以染色體結構異染色質也可能是促使體細胞染色體聯會的一種因素。Avivi等[14]在普通小麥中發現了影響體細胞同源染色體聯會的基因，而在植物減數分裂中也發現了一些控制同源染色體聯會的基因。這就說明不論在有絲分裂還是減數分裂過程中確實存在基因的調節作用，同時也解釋了為什么體細胞染色體的聯會現象只在部分物種中發現，而非廣泛的現象。

從本實驗的結果顯示出宜昌橙體細胞染色體聯會是非隨機的染色體行為，是相對穩定而且是以某種特異同源染色體為主，第2對同源染色體的短臂端部或者近端部，及第9對染色體的次縊痕區域上。通過以上綜合分析，提出宜昌橙體細胞染色體聯會現象并非隨機生物現象，而是宜昌橙固有的細胞學特征；其體細胞染色體聯會以同源染色體聯會為主，推測可能與異染色質集中區域或者結構形成有關。后續的進一步開展對宜昌橙體細胞染色體高級結構和特殊區域以及異染色質功能的研究具有重要的理論意義和應用價值。

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