柑橘花瓣灰霉病誘導的果面疤痕研究

摘要： 【目的】為了解柑橘花瓣灰霉病是否與成熟果實表面疤痕有關、所形成疤痕的特征以及灰霉病菌的種類，【方法】通過終花期掛牌跟蹤調查、人工接菌試驗和噴藥防治，綜合分析花瓣灰霉病與果面疤痕的關系及疤痕特征。【結果】結果表明，柑橘花瓣可受灰霉病菌感染而腐爛，腐爛花瓣不易脫落，黏貼在幼果上，滋生的病菌可引起幼果表皮形成凹陷斑點或斑塊。受害組織隨后木栓化，呈痘瘡狀或脊狀凸起。隨著果實的膨大，凸起部位逐漸變平坦，甚至稍下陷。疤痕表面粗糙，大小形狀各異，有淺裂紋，質地似軟木塞。菌絲塊接種發現病菌可以引起幼果表面產生黑褐色凹陷的斑點或斑塊，花期噴施速克靈可以部分降低疤痕果的比例。形態學和分子鑒定證明花瓣上的灰霉菌主要為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers. Ex. Fr.）。【結論】花瓣灰霉腐爛與果實表面疤痕有關。

關鍵詞： 柑橘果面疤痕； 花瓣灰霉病； 跟蹤調查； 施藥試驗； 接種試驗

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980201206-1074-04

隨著柑橘產業的發展、鮮果供應量的持續上升以及消費者對產品內在和外在品質要求的提高，柑橘果面疤痕對柑橘效益的影響日益顯著。引起果面疤痕的原因很多，有病菌感染引起，如瘡痂病（Elsinoe fawcettii Bitanc. Et. Jenk.）、潰瘍病（Xanthomonas campestris pv. citri （Hasse） Dye）、黑點病（沙皮病，Diaporthe citri F. A. Wolf）；有昆蟲引起，如薊馬等的危害；有枝、葉與幼果摩擦引起的機械擦傷和藥害等[1]。美國、新西蘭和日本均證實柑橘花期花瓣受灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers. Ex. Fr.）感染而腐爛的花瓣粘附在柑橘幼果表面，可傷及幼果果皮，最終在果皮上形成各種難看的疤痕，稱之為葡萄孢菌誘導的疤痕或病害（Botrytis-induced injury or disease）。然而已有的報道均未見癥狀發生發展的系統觀察記錄，對這種疤痕在成熟果實果面的特征也未見詳細的描述[2-3]。在國內對花瓣灰霉病誘導的柑橘果面疤痕問題雖有記述[4-6]，但這種觀點目前尚未得到普遍的認同，不少人持懷疑的態度。作者于2011年在浙江臨海開展了相關的試驗，結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 試驗基地

系統跟蹤調查在浙江省臨海市涌泉鎮浙江省豐甜水果合作社柑橘基地（馮昌滿農戶）進行，品種為溫州蜜柑（早熟宮川），8～10 a生。接種試驗在浙江大學華家池校區溫室內盆栽橘樹上進行，品種為溫州蜜柑，5 a生。

1.2 田間跟蹤調查

于2011年5月12日，柑橘終花期進行掛牌。選擇被滋生大量灰霉菌花瓣包裹著的幼果（霉果）掛以紅色塑料吊牌（浙江省臺州市金農篩網廠），共掛霉果830個；同時選擇無花瓣包裹的幼果（裸果）掛以藍色吊牌，共掛830個。為防止掛牌果因生理落果而無法跟蹤到癥狀發生發展的全過程，掛牌時疏除掛牌結果枝上若干幼果。于第一次生理落果結束（6月22日）、第二次生理落果結束（7月27）以及果實成熟期（11月1日）分別進行跟蹤調查，記錄果實表面有無疤痕產生以及疤痕的變化過程。

1.3 人工接種觀察

1.4 落花期噴藥試驗

1.5 葡萄孢菌的鑒定

25 ℃條件下，PDA培養基上培養7 d后，肉眼觀察菌落顏色、形狀，測量菌落直徑，計算菌絲生長速率。從發病花瓣或培養基上挑取病原菌培養物，置于顯微鏡下檢查分生孢子梗和分生孢子，記錄其形態特征，并測量尺度。采用SLS（月桂酰肌氨酸鈉）法[8]快速提取菌株H1和L1的基因組DNA，利用真菌核糖體 rDNA通用引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’）和ITS6（5’-GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3’），擴增18S rDNA 和28S rDNA 基因之間的2個轉錄間隔區序列（internal transcribed spacer），以及其中的5.8S基因序列（internal transcribed spacer，ITS）[9]。PCR產物純化后，利用pMD18-T載體連接，并轉化Escherichia coli DH5α。每個PCR產物挑選2個經過驗證有插入的單克隆，委托上海英俊公司進行正反雙向測序。測序結果用DNAman軟件進行初步編輯和比對，然后與GenBank數據庫中相關序列進行一致性比較。

2 結果與分析

2.1 灰霉病菌誘導疤痕的癥狀特點

第一次生理落果結束后（6月22）日，對所掛的830個果實跟蹤調查結果表明，裸果中有266個果實仍然保留在果枝上，坐果率為32%；而霉果所保留的果實只有106個，坐果率為13%，裸果的坐果率明顯高于霉果（P<0.05），可見花瓣灰霉病可顯著影響坐果率（表1）。在保留的果實中，裸果中有疤痕果的比例為30%，而霉果的疤痕果率為44%，顯著高于裸果。可見花瓣灰霉病與果實表面疤痕相關，同時也說明處花瓣灰霉病外，幼果發育過程中的其他因素也會引起果面疤痕。果實成熟期（11月2日）的調查結果與第一次生理落果后的情況基本一致（表1）。

田間調查表明，在盛花期，少數花瓣即可受灰霉病菌的感染，產生褐色水漬狀腐爛，并產生灰褐色的霉層。隨著花瓣的凋萎，褐色水漬狀腐爛的花瓣不斷增多。腐爛花瓣一般不易干枯脫落，有些粘附在萼片上，有的則緊貼著幼果，或包裹著幼果，其上滋生大量的霉狀物（圖版-A、B）。揭開霉爛的花瓣，可見幼果表面生有黑褐色、大小不等、略凹陷的小斑點或斑塊（圖版-C、D）。病菌也可蔓及萼片和果柄，致使幼果脫落。隨著幼果膨大，受感染而未脫落的幼果在感染處形成顆粒狀（圖版-E、F）、脊狀（圖版-G、H）或塊狀（圖版-I）等大小形狀不一的凸起，凸起組織表面幾層細胞木栓化，呈灰白色，褐色至紅褐色（圖版-E、G），或褐色和灰白色相間的斑塊（圖版-H、I）。隨著果實的進一步膨大，凸起處（疤痕處）的膨大因表皮細胞木栓化而受阻，凸起逐漸被拉平，致使在果實成熟時，疤痕處因木栓化表皮下的細胞生長受阻，而微微凹陷，疤痕處表面粗糙，常伴有細微裂紋（圖版-J～L、M）。

2.2 接種試驗

接種24 h后，肉眼可見灰霉病菌的菌絲已蔓延到幼果或花器上，接種4 d時可見幼果表面滋生的一些菌絲已形成菌絲墊，粘附在幼果上，墊下幼果表面產生大小不等的壞死斑點（圖版-N），紅褐色至黑褐色，略凹陷，嚴重時壞死點連成片，呈黑褐色（圖版-N）。病菌亦可蔓延至花萼和花柄，產生水漬狀、褐色腐爛，其上也滋生大量菌絲，這些菌絲很快形成灰色霉層（圖版-N），受害幼果很快從花柄處與小枝脫離而落果。4 d后，接種的75個幼果中有60個幼果表現癥狀，發病率為80%，7d后，所有發病果實均脫落；對照組共15個幼果，未產生明顯癥狀。

2.3 終花期噴藥對疤痕果形成的影響

調查結果表明，終花期噴施50%速克靈可濕性粉劑1 000倍液的處理，疤痕果率為22.1%，而噴清水的對照組的疤痕果率為37.2%，兩者存在極顯著性差異（P=0.001 2）。可見，終花期噴施針對灰霉病菌的殺菌劑可以顯著降低疤痕果率。

2.4 灰霉病菌種的地位確定

在PDA培養基上培養7 d（25 ℃），病菌的菌落較致密，呈圓形輻射狀，菌絲茂盛，白色至灰色，緊貼培養基生長（圖版-O），生長速率為1.29 cm·d-1。顯微鏡觀察發現，病菌的分生孢子梗無色，頂端細胞膨大成球形，其上產生許多小梗，分生孢子著生于小梗上聚集成葡萄穗狀（圖版-P）。

以基因組DNA為模板，采用通用引物ITS4和ITS6可從H1（登錄號：HQ171052）和L1（登錄號：HQ171053）菌株中分別擴增獲得大約650 bp的片段，克隆測序結果顯示兩菌株間的序列一致性為100%。取其中一個菌株的ITS序列到NCBI上進行比對，發現與已知的富氏葡萄孢盤菌（Botryotinia fuckeliana （de Bary） Whetzel， 無性態為灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers. Ex Fr，（Accession No.：EU 128648）的一致性達100%。表明引起柑橘花瓣灰霉病和由此誘導的果面疤痕病菌為富氏葡萄孢盤菌（灰葡萄孢菌）。

3 討 論

本研究通過掛牌跟蹤觀察和幼果接種試驗證明柑橘花瓣可受灰霉菌的感染，腐爛的花瓣如果粘附在幼果上，重者可引起落果，輕者可引起幼果表面創傷，最終引起帶疤痕的成熟果實。該灰霉菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），終花期噴施二甲酰亞胺類殺菌劑速克靈可濕性粉劑1 000倍液，可降低疤痕果率。研究結果不僅證實了前人的結論[3，5-6]，同時明確了灰葡萄孢菌誘導果面疤痕癥狀的發展過程，對如何識別灰葡萄菌誘導的疤痕果的識別和制定減輕柑橘疤痕果的措施提供科學依據。

灰葡萄孢菌屬于死體營養型病菌，分布廣，危害寄主幾乎包括所有栽培蔬菜、花卉和果樹，以及許多野生植物。病菌主要侵染幼嫩、肉質多水的組織和器官，如幼苗、花器、果實等。病菌的最適生長溫度為25 ℃，因此灰霉病的流行主要發生在溫度較低，濕度大的季節。在我國，柑橘的花期在4月中下旬至5月上中旬，期間的溫度一般在15～25 ℃間，適合病菌的生長和產孢。因此，一旦遇到花期多雨年份，或在郁閉的果園，花瓣感染灰霉菌發生灰霉病的幾率就會很高。

有關灰霉菌誘導的果面疤痕的控制，有人報道通過灑水可以在一定程度降低果面疤痕的產生[10]。Fullerton等[3]推薦使用氣壓泵將病變殘留的花瓣吹走，可以幫助控制該病害[3]。使用二甲酰亞胺類或苯并咪唑類殺菌劑，可以在一定程度減輕灰霉菌誘導的過面疤痕果[3]。本研究的結果也表明花期噴施二甲酰亞胺類殺菌劑速克靈可顯著降低疤痕果率。但本文只有一年一點數據，需要擴大試驗，進一步明確其效果。此外，避免在果園內套種番茄、辣椒等蔬菜，以免病菌的相互傳染，加重病情。據浙江臺州果農反映，搖動柑橘樹枝，抖落花瓣，減少花瓣粘附果實的機會，也可部分減少疤痕果率。（本文圖版見封底）

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