中國野生毛葡萄病原菌誘導(dǎo)響應(yīng)VqCOI1基因的克隆及表達(dá)分析

摘要: 【目的】為了驗證COI1基因在葡萄抗病防御機(jī)制中的作用，【方法】在前期通過抑制消減雜交技術(shù)（SSH）獲得中國野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’ COI1基因EST序列的基礎(chǔ)上，采用RT-PCR從毛葡萄‘商-24’中分離到COI1基因cDNA序列， 并通過實(shí)時定量PCR和半定量PCR分析了COI1基因的表達(dá)特異性，以期驗證其在葡萄抗病防御機(jī)制中的作用。【結(jié)果】序列分析表明，VqCOI1基因長2 455 bp，編碼598個氨基酸殘基，相對分子量為67.87 ku，等電點(diǎn)為5.85。同源性分析表明，它與已克隆的大豆（Glycine max）COI1基因（GenBank登錄號: AAZ66745.1）相似性最高為79%。實(shí)時定量PCR技術(shù)用來檢測VqCOI1基因在受到病原菌侵染和激素處理時在抗病品種‘商－24’中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，在白粉菌誘導(dǎo)初期，抗病的毛葡萄株系‘商-24’ VqCOI1基因表達(dá)量升高，這可能是因為它參與了病原菌誘導(dǎo)的JA信號調(diào)節(jié)途徑。水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（Eth）處理表明VqCOI1基因表達(dá)受激素分子調(diào)節(jié)，這些信號分子可能交叉調(diào)節(jié)這一基因的表達(dá)。在嫩葉、嫩莖、花、果皮、卷須等不同葡萄組織中的表達(dá)表明VqCOI1基因的表達(dá)具有空間差異性。【結(jié)論】這些結(jié)果暗示著VqCOI1的表達(dá)響應(yīng)病原菌侵染并受生物脅迫相關(guān)激素的調(diào)控，很有可能在葡萄防御病原菌侵染的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞: 中國野生葡萄； VqCOI1基因； 克隆； 表達(dá)分析

中圖分類號：Ｓ６６3．1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－990－０7

植物在自然條件下，長期的生長發(fā)育過程中常常受到周圍環(huán)境中各種因子的刺激，例如干旱、水淹、高鹽、低溫、病毒、細(xì)菌和真菌等， 當(dāng)植物受到病原菌侵染時，隨著植物與病原菌的長期互作，協(xié)同作用，已經(jīng)進(jìn)化出了許多防御抗性機(jī)制來抵抗病原微生物的侵襲。這種防御機(jī)制包括植物自身的一些生理作用或化學(xué)障礙物以及病原物侵染植物后誘導(dǎo)植物一系列防衛(wèi)反應(yīng)的發(fā)生。許多植物的代謝過程都是受到多種酶的合成與降解的平衡作用調(diào)控的，其中，植物通過泛素化途徑對許多蛋白的降解過程在植物的抗病反應(yīng)中起著重要作用。許多研究表明，E3泛素連接酶和相關(guān)蛋白的降解在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要作用，并最終導(dǎo)致植物抗病性的發(fā)生[1-2]。

病蟲害的侵染會刺激植物體內(nèi)的合成JA和Eth，啟動植物內(nèi)源信號分子的調(diào)節(jié)，進(jìn)而激活一些病程相關(guān)蛋白的表達(dá)，各種途徑相互交叉，使得植物形成對病原菌的應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，JA信號途徑在植物抗性調(diào)節(jié)中起著重要作用[3]。COI1基因是是目前所發(fā)現(xiàn)的擬南芥茉莉酸信號傳導(dǎo)途徑中最重要的調(diào)控基因。它與植物的育性和抗性兩類完全不同的性狀有關(guān)。COI1蛋白包含有一個F-BOX結(jié)構(gòu)域和不完整的富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域（LRR），它是一個新的F-BOX蛋白[4]。它可以與ASK1/ASK2、CUL1和RBX1結(jié)合，形成SCFCOI1 E3連接酶復(fù)合體[5]，這個SCFCOI1 E3復(fù)合物可以特異識別茉莉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一些調(diào)控因子，使其泛素化而由26s蛋白體降解，從而開啟下游基因的表達(dá)和下游茉莉素信號傳導(dǎo)，調(diào)控植物的生長發(fā)育和抗逆性。在擬南芥coil1突變體發(fā)現(xiàn)后的十年中，一直沒有找到 SCFCOI1的靶蛋白。直到 2007年，3個課題組分別利用不同的方法同時發(fā)現(xiàn)了擬南芥中茉莉酸信號途徑的重要調(diào)控因子-JAZ蛋白[6]。Thines 等[6]利用了JAZ1-GUS融合蛋白證明了JAZ蛋白為SCFCOI1的底物。Yan等[7]采用生物芯片技術(shù)進(jìn)一步證明了這種蛋白質(zhì)是茉莉酸響應(yīng)基因的負(fù)調(diào)控因子。由于它特有的jas保守結(jié)構(gòu)域，它可以通過COI1介導(dǎo)的植物泛素化途徑調(diào)節(jié)植物早期抗性反應(yīng)和誘導(dǎo)植物抗病性。目前，COI1在葡萄等單子葉植物中的分子機(jī)制尚不清楚。由于葡萄白粉病[Uncinula necator （Schw.） Burr]在世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重危害性，為了深入了解葡萄抗白粉病分子機(jī)理，項目組在前期構(gòu)建了接種與未接種白粉菌的高抗白粉病的中國野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’ SSH文庫，獲得了COI1基因的EST序列（GenBank number: JK266496）。我們就是在此基礎(chǔ)上，采用RT-PCR技術(shù)克隆了中國野生葡萄COI1基因，并進(jìn)行表達(dá)分析，為進(jìn)一步深入了解COI1 基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 葡萄材料與處理

采集毛葡萄‘商-24’嫩葉、嫩莖、花、果皮、卷須不同組織，迅速置于液氮罐帶回實(shí)驗室-80 ℃凍存。

1.2 總RNA提取與cDNA第1鏈合成

葡萄葉片總RNA的提取參照張今今等[8]改進(jìn)的SDS酚法， 葡萄葉片總RNA的純化參照王西平[9]的方法進(jìn)行。取RNA 1 μL（濃度為1 g·L-1），1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。其中，用于RT-PCR和Real-time PCR技術(shù)的第1鏈cDNA的合成按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。

1.3 中國野生毛葡萄COI1基因克隆

1.4 VqCOI1基因序列分析

將獲得的序列用Blastp（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）程序在NCBI網(wǎng)站通過同源性比對驗證基因的完整性。用ProtParam程序預(yù)測克隆得到基因所編碼產(chǎn)物的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、分子量和等電點(diǎn)。利用CLUSTALW（http: //align. genome. jp/clustalw/）在線分析軟件對不同物種的COI1基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.5 VqCOI1基因表達(dá)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 中國野生毛葡萄VqCOI1基因的克隆及序列分析

3 討 論

在本課題組前期構(gòu)建的白粉菌誘導(dǎo)下的中國野生華東葡萄‘商-24’ cDNA 文庫中篩選獲得的與衰老相關(guān)蛋白基因相關(guān)的 EST 序列的基礎(chǔ)上，克隆了VqCOI1基因。VqCOI1 基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析說明該基因的表達(dá)具有空間差異性。病原菌誘導(dǎo)后的實(shí)時定量結(jié)果表明，COI1基因參與了植物早期的抗病反應(yīng)，通過病原菌的侵染，啟動植物體內(nèi)源激素分子的調(diào)控途徑，參與泛素化途徑的降解作用，激活病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。外源施加水楊酸、茉莉酸、乙烯這3種激素時，COI1基因也誘導(dǎo)表達(dá)，MeJA處理下，COI1參與了JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過選擇性地結(jié)合JA 應(yīng)答反應(yīng)的抑制因子，介導(dǎo)該抑制因子與泛素結(jié)合，然后通過泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解途徑使該抑制因子失活，由此開啟JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使植物產(chǎn)生 JA 應(yīng)答反應(yīng)。

乙烯作為一種重要的氣態(tài)激素分子，也參與了植物對病原菌等生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[10]。ERF是乙烯調(diào)控途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以參與植物防衛(wèi)反應(yīng)的發(fā)生，除了乙烯，ERF也參與了茉莉酸和水楊酸介導(dǎo)的信號途徑，從而調(diào)控植物下游抗病基因的表達(dá)。有研究明確指出，乙烯參與了許多防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)，其中包括一些PR蛋白如幾丁質(zhì)酶，PR-1，防衛(wèi)素和植物抗毒素合成酶等[11]。定量結(jié)果表明，乙烯處理可以誘導(dǎo)COI1基因的表達(dá)，由于JA/ET信號途徑與SA信號途徑之間存著顯著的交叉，乙烯處理后如何參與COI1基因的表達(dá)仍需進(jìn)一步研究。

SA介導(dǎo)的植物信號途徑參與到“基因?qū)颉奔僬f[12]的抗性反應(yīng)中，植物體內(nèi)內(nèi)源水楊酸信號分子的積累會誘導(dǎo)多種病程相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘發(fā)植物獲得系統(tǒng)抗性。研究表明，當(dāng)病原菌侵染煙草，黃瓜和擬南芥時，被侵染植物葉片內(nèi)的水楊酸含量迅速上升，最終誘發(fā)植物系統(tǒng)獲得性抗性的發(fā)生[13-14]。此外，外源施加SA也能使誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗性反應(yīng)的發(fā)生，從而使植物抵抗病原菌的侵入。SA刺激后COI1基因的表達(dá)明顯升高，這可能是由于水楊酸能夠通過專一地抑制過氧化氫酶活性來增加植物體內(nèi)H2O2的含量，進(jìn)而導(dǎo)致一些與SAR有關(guān)的防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)，最終使植物獲得抗病性[15-17]。

目前JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在單子葉植物中的研究很少，VqCOI1 基因的獲得為研究葡萄中JA應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制提供了很好的基礎(chǔ)。這對于揭示葡萄抗逆機(jī)理，尋找有效的途徑來提高葡萄抗病性有著非常重要的意義。

4 結(jié) 論

對VqCOI1基因在受到病原菌侵染和不同信號分子刺激時的表達(dá)研究初步證明了該基因響應(yīng)葡萄白粉病病原菌的侵染并受生物脅迫不同激素的調(diào)節(jié)作用，而這些激素均是病原菌響應(yīng)的信號分子，推測VqCOI1基因可能參與植物的抗病調(diào)節(jié)過程，將VqCOI1基因的表達(dá)與葡萄白粉病的抗病機(jī)制相結(jié)合將為后續(xù)葡萄抗白粉病的轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn) References:

[1] ZENG L R， VEGA-SANCHEZ M E， ZHU T， WANG G L. Ubiquitination-mediated protein degradation and modi cation: an emerging theme in plant-microbe interactions[J]. Cell Res，2006，16: 413-426.

[2] DREHER K， CALLIS J. Ubiquitin， hormones and biotic stress in plants[J]. Ann Bot， 2007， 99 （5）: 787-822.

[3] BROWSE J， HOWE G A. New weapons and a rapid response against insect attack[J]. Plant Physiol， 2008， 146: 832-838.

[4] XIE D X， FEYS B F， JAMES S， NIETO-ROSTRO M， TURNER J G. COI1: an Arabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense and fertility[J]. Science， 1998， 280: 1091-1094.

[5] XU L， LIU F， LECHNER E， GENSCHIK P， CROSBY WL， MA H， PENG W， HUANG D， XIE D. The SCFCOI1 ubiquitin-ligase complexes are required for jasmonate response in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2002， 14: 1919-1935.

[6] THINES B， KATSIR L， MELOTTO M， NIU Y， MANDAOKAR A， LIU G， NOMURA K， HE S Y， HOWE G A. JAZ repressor proteins are targets of the SCFCOI1 complex during jasmonate signalling[J]. Nature， 2007， 448: 661-665.

[7] YAN Y， STOLZ S， CHETELAT A， REYMOND P， PAGNI M， DUBUGNON L， FARMER E E. A downstream mediator in the growth repression limb of the jasmonate pathway[J]. The Plant Cell， 2007， 19 （8）: 2470-2483.

[8] ZHANG Jin-jin， WANG Yue-jin， WANG Xi-ping，YANG Ke-qiang，YANG Jin-xiao. An improved method for rapidly extracting total RNA from Vitis[J]. Journal of Fruit Science， 2003， 20 （3）: 178 -181.

張今今， 王躍進(jìn)， 王西平， 楊克強(qiáng)， 楊進(jìn)孝. 葡萄總RNA提取方法的研究[J]. 果樹學(xué)報， 2003， 20 （3）: 178-181.

[9] WANG Xi-ping. Cloning and analysing for the gene sequences of resistance to Uncinula Necator in Chinese wild Vitis species[D]. Yangling: Northwest A F University， 2004.

王西平. 中國葡萄野生種抗白粉病基因克隆與序列分析[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué)，2004.

[10] BROEKAERT W F， DELAUR?魪 S L， DE BOLLE M F C， CAMMUE B P A. The role of ethylene in host-pathogen interactions. Annu. Rev [J]. Phytopathol， 2006， 44: 393-416.

[11] GE Bao-yu. Isolation and analysi of sequences and screening transgenic plants of ERF genes in grape （Vitis aestivalis）[D]. Liaoning: Liaoning Normal University， 2008.

葛寶宇. 野生夏葡萄ERF基因的分離克隆，序列分析及轉(zhuǎn)基因植株的篩選 [D]. 遼寧: 遼寧師范大學(xué)， 2008.

[12] FLOR H H. Current status of the gene-for-gene concept[J]. Ann Rev Phytopathol， 1971， 9:275-296.

[13] ENYEDI A J， YALPANI N， SILVERMAN P， RASKIN I. Localization， conjugation， and function of salicylic acid in tobacco during the hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1992， 89（6）: 2480-2484.

[14] WARD E R，UKNES S J，WILLIAMS S C，DINCHER S S， WIEDERHOLD D L，ALEXANDER D C，AHL-GOY P，M?魪TRAUX J P， RYALS J A. Coordinate gene activity in response to agents that induce systemic acquired resistance[J]. The Plant Cell，1991，3: 1085－1094.

[15] YUAN Yong-bing， CAO Zong-xun. The role of salicylic acid in plants[J]. Chinese Bulletin of Botany， 1994， 11（3）: 1-9.

原永兵， 曹宗巽. 水楊酸在植物體內(nèi)的作用[J]. 植物學(xué)通報， 1994， 11（3）: 1-9.

[16] LIU Jian-liang， HUANG Xiao-dan， FU Zhi-dong， HE Song-lin. Induced resistance effect of salicyl acid on anthracnose of mango fruits （colletotrichum gloesporioides）[J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany， 1998，6（3）: 245-248.

柳建良， 黃小丹， 傅熾棟， 何松林. 水楊酸對芒果炭疽病的誘導(dǎo)抗性作用[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報， 1998， 6（3）: 245-248.

[17] ZHANG Wei-li， GUO Zhen-fei， HE Hua-xuan. Stylosanthes guianensis resistance to Colletotrichum gloeosporiodes induced by salicylic acid and qxalate[J]. Chinese Journal of Grassland，2006，28（4）: 53-58.

張偉麗， 郭振飛， 何華玄. 水楊酸和草酸誘導(dǎo)柱花草對炭疽病的抗性[J]. 中國草地學(xué)報， 2006， 28 （4）: 53-58.