低溫脅迫對(duì)砧木及釀酒葡萄枝條抗寒性的影響

摘要： 【目的】為了探明低溫脅迫對(duì)砧木及釀酒葡萄枝條抗寒性的影響，【方法】以甘肅紫軒葡萄酒業(yè)葡萄園中6種砧木及釀酒葡萄品種為試材，分別測定了在不同低溫處理下各品種的電導(dǎo)率、可溶性糖、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）及過氧化氫酶（CAT）的活性。【結(jié)果】結(jié)果表明，6個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率隨著溫度的降低均呈現(xiàn)出顯著遞增趨勢(shì)；所有葡萄品種SOD、CAT含量變化均呈先升高后下降的趨勢(shì)；與6種葡萄品種抗寒性關(guān)系密切的生理指標(biāo)為可溶性糖和電導(dǎo)率，通過隸屬函數(shù)法綜合評(píng)判得到抗寒性大小依次為‘貝達(dá)’>‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’>‘雙紅’+‘貝達(dá)’>‘維代爾’>‘赤霞珠’>‘梅鹿輒’。【結(jié)論】研究為釀酒葡萄的引種與栽培管理提供了一定的理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： 釀酒葡萄； 低溫脅迫； 抗寒性； 生理指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2012？雪06-1040-07

葡萄為落葉藤本植物，是世界最古老的植物之一，喜溫喜光果樹，其生長條件要求高光照及適宜溫度。我國的葡萄產(chǎn)地主要集中在北方地區(qū)，但是北方的嚴(yán)寒氣候是制約鮮食葡萄及釀酒葡萄大規(guī)模生產(chǎn)的重要限制因子[1-3]。甘肅紫軒葡萄酒業(yè)葡萄園位于河西走廊中西部，干旱少雨，光照強(qiáng)，熱量適中，空氣干燥，無工業(yè)污染，氣候條件非常適宜釀酒葡萄的種植，已成為我國主要的葡萄生產(chǎn)基地之一，也是中國釀制高品質(zhì)葡萄酒的綠色食品基地，但是冬季的嚴(yán)寒氣候給葡萄生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著該地區(qū)釀酒葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此重視并解決該地區(qū)的嚴(yán)寒氣候?qū)︶劸破咸焉a(chǎn)的影響和制約，對(duì)嘉峪關(guān)市乃至整個(gè)北方地區(qū)的葡萄生產(chǎn)有著重要的意義。

目前通過對(duì)葡萄抗寒性生理生化指標(biāo)的測定來進(jìn)行抗寒性品種篩選已有很多報(bào)道，曹建東等[4]以葡萄不同砧木品種為研究對(duì)象，隨著處理溫度的降低，各品種的電導(dǎo)率、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸和丙二醛（MDA）含量逐漸升高，并且各品種升降的速度和幅度有明顯差異，并篩選出電導(dǎo)率以及可溶性蛋白、脯氨酸、MDA含量可以作為葡萄抗寒性評(píng)價(jià)的鑒定指標(biāo)。高秀萍等[5]通過對(duì)葡萄砧木品種根系抗寒性測定，將其劃分為極度抗寒、抗寒、較抗寒和不抗寒4種，同時(shí)對(duì)抗根癌病也做了相應(yīng)劃分。牛錦鳳等[1]研究認(rèn)為在品種抗寒性差異比較大時(shí)可用電導(dǎo)率法測定，既簡便又節(jié)省費(fèi)用，抗寒性差別比較小時(shí)則可采用過氧化物酶和可溶性糖測定，若要精細(xì)比較抗寒性采用電導(dǎo)率、過氧化物酶、可溶性糖、脯氨酸和MDA的綜合測定。從前人的研究結(jié)果來看，在低溫條件下對(duì)不同葡萄品種抗寒性研究大都局限在生理生化指標(biāo)的測定，而目前并沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來對(duì)不同葡萄品種抗寒性進(jìn)行測定及綜合評(píng)價(jià)。同時(shí)前人在對(duì)其他生理脅迫，如抗旱性[6-7]、鹽脅迫[8-9]、高溫脅迫[10]及其他作物的抗寒性[11-12]等探討較多，但對(duì)于葡萄抗寒性的測定及綜合評(píng)價(jià)體系方面的研究報(bào)道很少，尤其是關(guān)于釀酒葡萄此方面的研究報(bào)道相對(duì)空白[2，13]。我們針對(duì)甘肅省河西戈壁地區(qū)特殊的氣候條件，對(duì)該地區(qū)的6種砧木及釀酒葡萄品種進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)篩選和綜合評(píng)價(jià)，以期為該地區(qū)釀酒葡萄生產(chǎn)、種質(zhì)篩選和新品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況及供試材料

實(shí)驗(yàn)材料取自甘肅紫軒葡萄酒業(yè)釀酒葡萄種植園，該園地處祁連山北麓，位于北緯39°6′，該區(qū)屬典型的大陸性荒漠氣候，年均氣溫8.0 ℃，年極端最高氣溫為38.6 ℃，極端最低氣溫-31.7 ℃，最大凍土深度1.20 m，年均氣溫日較差15.3 ℃，無霜期130 d，年均降水量73.3 mm；太陽總輻射達(dá)到560.12～576.84 kJ·cm-2，pH 7.5～8.8[14]；灌溉條件為滴灌，土壤為砂礫土。

供試材料均為3 a生葡萄植株，管理水平一致，栽培樹形采用單株單蔓傾斜式上架，栽植密度為3 m×0.5 m，6個(gè)釀酒品種分別為‘雙優(yōu)’嫁接于‘貝達(dá)’（‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’）、‘梅鹿輒’、‘貝達(dá)’、‘雙紅’嫁接于‘貝達(dá)’（‘雙紅’+‘貝達(dá)’）、‘赤霞珠’、‘維代爾’。于2011年4月15日（越冬后）每一品種選3～5株，每株剪取40～50 cm長的1 a生枝條1～2枝，立即用聚乙烯膜包裹剪口，放置冰袋中帶回實(shí)驗(yàn)室置于-4 ℃冰箱備用。

1.2 材料處理

將供試材料隨機(jī)選取數(shù)枝，剪成10～15 cm的長度，先用流水沖洗，后蒸餾水沖洗數(shù)遍，濾紙擦干放入冰箱進(jìn)行溫度處理，設(shè)定溫度依次為4 ℃（對(duì)照）、0 ℃、-7 ℃、-15 ℃、-20 ℃，處理時(shí)間為10 h。將處理后的枝條在室溫下恢復(fù)30 min后避開芽眼切成3～5 mm的薄片混勻后稱取適量，測定各指標(biāo)（3個(gè)重復(fù)）。

1.3 測定指標(biāo)及方法

相對(duì)電導(dǎo)率參照李合生[15]方法使用DDS-12A型電導(dǎo)儀測定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[16]；SOD活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測定[16]；CAT活性采用紫外吸收法測定[17]；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法測定[18]，可溶性糖含量測定采用蒽酮法[19]，脯氨酸含量采用茚三酮比色法測定[16]。

1.4 抗寒性綜合評(píng)價(jià)

應(yīng)用隸屬函數(shù)法[11，20-21]進(jìn)行綜合評(píng)判。（1）與抗寒性呈正相關(guān)的參數(shù)SOD、脯氨酸、可溶性糖、CAT計(jì)算公式： U（Xijk）=（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（2）與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)電導(dǎo)率、MDA計(jì)算公式： U（Xijk）=1-（Xijk-Xmin）/（Xmax-Xmin）。（1）、（2）中U（Xijk）表示各指標(biāo)的隸屬度值；Xijk表示表示各指標(biāo)值測定值；Xmax、Xmin為所有品種第k項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值。用各項(xiàng)指標(biāo)隸屬度的平均值作為樹種抗寒能力綜合評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行比較。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用microsoft office excel 2007和spss 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對(duì)不同釀酒葡萄品種相對(duì)電導(dǎo)率影響

由表1可知，各釀酒葡萄品種在4～-20 ℃溫度依次遞減的條件下，低溫對(duì)細(xì)胞膜的傷害逐漸增大，細(xì)胞膜透性逐漸增加。6個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)出顯著遞增趨勢(shì)，4 ℃最低，-20 ℃最高，且各溫度條件下電導(dǎo)率值差異顯著（P<0.05），在-20 ℃時(shí)，各品種間的電導(dǎo)率差異較大，其中‘梅鹿輒’電導(dǎo)率最大（80.9%），‘貝達(dá)’電導(dǎo)率最小（62.24%）。一般選擇相對(duì)電導(dǎo)率50%作為植物組織活性的耐性臨界值，超過耐性臨界值的溫度可以作為半致死溫度[22-24]。在高于-7 ℃各品種的相對(duì)電導(dǎo)率均小于50%，-7 ℃溫度下‘梅鹿輒’（59.51%）、‘赤霞珠’（63.08%）、‘維代爾’（52.85%）電導(dǎo)率值均超過50%，‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’、‘貝達(dá)’、‘雙紅’+‘貝達(dá)’的電導(dǎo)率在-15 ℃下分別為54.82%、55.68%、49.27%，說明‘梅鹿輒’、‘赤霞珠’、‘維代爾’的半致死溫度高于-7 ℃，而‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’、‘貝達(dá)’、‘雙紅’+‘貝達(dá)’的半致死溫度在 -15 ℃左右。同時(shí)推測-7 ℃左右是‘梅鹿輒’、‘赤霞珠’、‘維代爾’品種耐受的一個(gè)溫度閾值，在此溫度條件下，應(yīng)注意加強(qiáng)這些品種防寒防凍的大田管理。

2.2 低溫處理對(duì)不同釀酒葡萄品種POD、SOD活性的影響

由圖1（A）可知，6個(gè)品種的POD活性隨著溫度的降低呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)，‘梅鹿輒’和‘赤霞珠’在4～-20 ℃各溫度條件下，POD活性顯著低于其他品種（P<0.05）；在-7 ℃溫度條件下，‘梅鹿輒’、‘貝達(dá)’、‘雙紅’+‘貝達(dá)’、‘維代爾’的POD活性較0 ℃降幅較大，分別為78%、53%、40%、53%，推測-7 ℃左右也是幾種葡萄的耐受溫度，可以在低于此溫度下啟動(dòng)相關(guān)酶對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)措施。

由圖1（B）可知，所有葡萄品種SOD含量變化均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，但是各品種SOD活性到達(dá)峰值的溫度及降幅不同，‘梅鹿輒’、‘赤霞珠’、‘維代爾’、‘雙紅’+‘貝達(dá)’均在-7 ℃左右時(shí)SOD活性達(dá)到峰值，在-7 ℃～-20 ℃時(shí)SOD活性差異顯著（P<0.05），且較其他品種SOD活性降幅迅速，分別為30%、20%、26%、23%，說明低于-7 ℃葡萄品種的枝條已經(jīng)受到一定程度的損傷，SOD對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)已經(jīng)到達(dá)極限，酶系統(tǒng)受到破壞，SOD活性降低。‘貝達(dá)’和‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’均在0 ℃左右時(shí)SOD活性達(dá)到峰值，低于0 ℃時(shí)SOD活性緩慢降低，推測在這2個(gè)品種中SOD的穩(wěn)定性較低。

2.3 低溫處理對(duì)不同釀酒葡萄品種CAT活性的影響

如圖1（C）所示，隨著溫度的逐漸降低，6個(gè)葡萄品種的CAT含量均呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，‘梅鹿輒’、‘貝達(dá)’、‘雙紅’+‘貝達(dá)’、‘赤霞珠’均在-7 ℃時(shí)CAT活性達(dá)到峰值，分別為90.88、103.58、99.5、96.13，在低于-7 ℃時(shí)CAT活性開始降低，其中‘梅鹿輒’降幅最小，推測-7 ℃為一個(gè)較為重要的溫度拐點(diǎn)，可能同SOD一樣，低于-7 ℃破壞了相關(guān)保護(hù)酶而CAT含量降低。‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’CAT活性峰值出現(xiàn)在-15 ℃，低于此溫度開始降低，而‘維代爾’在0 ℃時(shí)CAT活性已經(jīng)達(dá)到了峰值，低于0 ℃時(shí)CAT活性開始降低。

2.4 低溫處理對(duì)不同釀酒葡萄品種MDA和脯氨酸含量的影響

低溫脅迫下，6種葡萄品種MDA含量變化如圖2（A）所示，隨著溫度的降低，6種葡萄品種的MDA含量均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，且其余低溫處理均高于對(duì)照（4 ℃），在-20 ℃溫度下MDA含量達(dá)到最大。其中‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’、‘貝達(dá)’、‘雙紅’+‘貝達(dá)’的MDA含量較其他品種持續(xù)處于較低水平，且4 ℃～-20 ℃下MDA含量差異不顯著（P>0.05），‘赤霞珠’和‘維代爾’的MDA含量居中，且差異不顯著（P>0.05），而‘梅鹿輒’的MDA含量一直處于較高水平，且顯著高于其他品種。從MDA含量的變化來看，在低溫脅迫下‘梅鹿輒’的細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損程度最高，膜脂過氧化程度最嚴(yán)重，膜透性最大。

在低溫脅迫下，6種釀酒葡萄品種脯氨酸含量變化如圖2（B），反映了脯氨酸含量隨著溫度的降低呈現(xiàn)了持續(xù)升高的特征，說明在逆境條件下，葡萄對(duì)低溫脅迫表現(xiàn)出積極的響應(yīng)。總體來看，‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’、‘貝達(dá)’和‘雙紅’+‘貝達(dá)’3個(gè)品種脯氨酸含量較高。

2.5 低溫處理對(duì)不同釀酒葡萄品種可溶性糖含量的影響

如圖2（C）所示，各品種都隨著處理溫度的降低而呈現(xiàn)出先增高后下降的趨勢(shì)，‘梅鹿輒’、‘貝達(dá)’、‘雙紅’+‘貝達(dá)’、‘維代爾’的可溶性糖含量均在-7 ℃出現(xiàn)峰值，在0 ℃～-7 ℃溫度范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，-7 ℃ ～-15 ℃呈下降趨勢(shì)。‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’和‘赤霞珠’的可溶性糖含量峰值出現(xiàn)在-15 ℃，總體來看，‘貝達(dá)’和‘雙紅’+‘貝達(dá)’2個(gè)品種可溶性糖含量顯著高于其他品種（P<0.05），而‘梅鹿輒’的可溶性糖含量較低。

2.6 應(yīng)用隸屬函數(shù)法對(duì)6種釀酒葡萄抗寒性的綜合評(píng)價(jià)

從表2判定6種釀酒葡萄品種的抗寒性大小依次為‘貝達(dá)’>‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’>‘雙紅’+‘貝達(dá)’>‘維代爾’>‘赤霞珠’>‘梅鹿輒’。通過本研究可知，電導(dǎo)率和可溶性糖含量與抗寒性關(guān)系密切，可以作為6種砧木及釀酒葡萄抗寒性大小的鑒定指標(biāo)，其他指標(biāo)與抗寒性關(guān)系不密切，不宜直接作為6種砧木及釀酒葡萄抗寒性的鑒定指標(biāo)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)6種釀酒葡萄相對(duì)電導(dǎo)率的測定，結(jié)果顯示，各品種相對(duì)電導(dǎo)率隨著脅迫溫度的逐漸降低而增大，這與王燕凌等[25]和肖用森等[26]研究結(jié)果一致。同時(shí)大致推測對(duì)溫度較為敏感的品種，在-7 ℃左右（電導(dǎo)率超過50%）為其耐性臨界值，如釀酒葡萄‘梅鹿輒’在-7 ℃左右埋土枝條對(duì)低溫開始了積極響應(yīng)，而抗寒性強(qiáng)的山葡萄的埋土防寒溫度為-17 ℃左右，因此在嘉峪關(guān)市特殊的地理及氣候條件下進(jìn)行大田管理時(shí)應(yīng)予以重視。本研究在人工模擬低溫脅迫下得到-7 ℃為各指標(biāo)變化的重要拐點(diǎn)，推測在此溫度下，葡萄枝條內(nèi)各指標(biāo)對(duì)低溫開始一系列復(fù)雜的生理響應(yīng)，因此還需結(jié)合自然降溫進(jìn)一步探討。

可溶性糖和游離脯氨酸是植物體內(nèi)的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，糖在植物的抗寒生理中，可以提高細(xì)胞的滲透濃度，降低水勢(shì)，增加植株的保水能力，從而使冰點(diǎn)下降，可以緩和細(xì)胞質(zhì)過度脫水，保持細(xì)胞不致遇冷凝固，從而提高植物抗寒性[4]。本研究結(jié)果說明葡萄枝條在受到低溫脅迫時(shí)，能夠產(chǎn)生較多的糖來保護(hù)機(jī)體，起到調(diào)節(jié)機(jī)體的作用，‘貝達(dá)’和‘雙紅’+‘貝達(dá)’最高，抗寒性較強(qiáng)，‘梅鹿輒’可溶性糖含量最低，抗寒性最弱，其他品種居中。可溶性糖含量與抗寒性關(guān)系密切，可以作為6種砧木及釀酒葡萄抗寒性鑒定的生理指標(biāo)，這與牛錦鳳等[1]對(duì)鮮食葡萄抗寒性的研究結(jié)果一致。

低溫環(huán)境使植物體內(nèi)積累脯氨酸，多項(xiàng)研究表明，脯氨酸含量越高，植物的抗寒性越強(qiáng)[27]。在本研究中，脯氨酸含量隨著處理溫度的逐漸降低呈現(xiàn)了持續(xù)升高的特征，但是脯氨酸含量與抗寒性之間不存在相關(guān)關(guān)系，Sanchez 等[28]研究認(rèn)為，植物體內(nèi)脯氨酸在脅迫響應(yīng)中的角色尚不明確，一般認(rèn)為是作為滲透活性物質(zhì)發(fā)揮保護(hù)作用，其滲透調(diào)節(jié)在豆類植物中作用甚微。因此能否依照脯氨酸大小作為抗寒性的評(píng)判指標(biāo)還有待進(jìn)一步探討，用綜合評(píng)判法進(jìn)行相互印證非常重要，這也與司劍華等[29]研究結(jié)果一致。

MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，也是衡量膜系統(tǒng)受害的重要指標(biāo)之一[11]。經(jīng)過低溫處理后，MDA的含量通常增加，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著脅迫溫度的增加，MDA含量均呈逐步上升的趨勢(shì)，這也與牛錦鳳等[1]研究結(jié)果一致。

SOD、CAT和POD保護(hù)酶的活性也與抗寒性有著密切的關(guān)系。在本試驗(yàn)中，6種砧木及釀酒葡萄枝條POD含量隨著脅迫溫度的降低而呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)，但SOD和CAT含量均為先升高后降低，這可能是植物細(xì)胞對(duì)低溫脅迫的一種保護(hù)性應(yīng)急反應(yīng)，故通過低溫鍛煉的誘導(dǎo)可使葡萄細(xì)胞內(nèi)防御活性氧的酶促保護(hù)系統(tǒng)能力增強(qiáng)，從而維持了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，提高了葡萄的耐寒性，但隨著脅迫溫度的進(jìn)一步降低，超出了品種的耐受范圍使細(xì)胞膜受損而呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。

木本植物的抗寒性是由許多數(shù)量或質(zhì)量遺傳基因綜合作用累加的結(jié)果，每一個(gè)與抗寒性有關(guān)的性狀對(duì)木本植物的抗寒性都起一定的作用，但這種作用是微效的[30]。因此要判斷釀酒葡萄的抗寒性，需要對(duì)各抗寒性生理指標(biāo)進(jìn)行綜合判斷，而單一的某一個(gè)指標(biāo)具有片面性，通過對(duì)各生理指標(biāo)進(jìn)行數(shù)量化分析，得到綜合指標(biāo)的平均隸屬度。本實(shí)驗(yàn)對(duì)6種砧木及釀酒葡萄的7項(xiàng)抗寒性生理指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)法綜合分析，得出抗寒性大小的次序依次為‘貝達(dá)’>‘雙優(yōu)’+‘貝達(dá)’>‘雙紅’+‘貝達(dá)’>‘維代爾’>‘赤霞珠’>‘梅鹿輒’，同時(shí)通過對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的測定結(jié)果分析來看，以上葡萄品種有些是對(duì)低溫的滯緩響應(yīng)型品種，如在-15 ℃左右時(shí)才達(dá)到指標(biāo)峰值，有些是快速低溫響應(yīng)型品種，如在-7 ℃左右時(shí)已達(dá)到指標(biāo)峰值。因此對(duì)于園藝工作者來講，掌握各葡萄品種的冬季抗寒能力強(qiáng)弱，并了解其對(duì)冬季低溫響應(yīng)的進(jìn)程，有針對(duì)性的加強(qiáng)冬季的防寒管理，對(duì)釀酒葡萄在嘉峪關(guān)市的引種與栽培管理工作有實(shí)際指導(dǎo)意義。

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