生物乙醇生產(chǎn)及纖維素酶的開發(fā)進(jìn)展

摘要：隨著石化燃料由短缺變成枯竭，能源危機(jī)是人類面臨的共同問題。尋找新的能量來源關(guān)系到經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展乃至人類的生存問題，生物乙醇作為一種可再生的、經(jīng)濟(jì)上可承受的，并且對環(huán)境安全的能源物質(zhì)將逐漸成為石油的替代品。提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低纖維素酶的成本成為提高纖維素生產(chǎn)生物乙醇的市場的競爭力的關(guān)鍵因素。該文從生物乙醇的產(chǎn)業(yè)發(fā)展和纖維素酶的開發(fā)進(jìn)展進(jìn)行綜述，為今后生物乙醇生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的提升、纖維素酶工程菌的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：生物乙醇 纖維素酶 工程菌株

The study and development progress of Bio-ethanol and cellulase production

Liping Yang1 Shuiwen Cai1 Ling Luo1 Hui Liu1，2

1. Changsha Environmental Protection and Professional technique College， 410004 2 Hunan

2. Agricultural university， 410128， Changsha， China

Abstract: With the fossil fuels from shortage to exhaustibility， the humanity is facing toward a common problem in energy crisis. Finding new energy sources is important to sustainable economic development and even human survival. Bio-ethanol， as an energy source that is renewable， affordable， and environmentally safe， will become a substitute for oil. Elevation of cellulase production and reduction of the cellulase production cost are the key factor for enhancing the market competitiveness of cellulosic bioethanol. In this paper， we discussed the development progress of bio-ethanol and cellulose industry to provide a basis for the future upgrading of bio-ethanol production industry and the development of gene engineering strain.

Keywords: bio-ethanol cellulose engineering strain

隨著石化燃料由短缺變成枯竭，能源危機(jī)是人類面臨的共同問題。1998年，Campbell和Laherrere對石油儲備和未開發(fā)的石油進(jìn)行評估后認(rèn)為，天然油在2010年前的產(chǎn)量就開始下降，到2050年全球每年石油供應(yīng)量將從目前的25億桶下降到5億桶[1]。隨著石化燃料供應(yīng)的減少，尋找新的能量來源關(guān)系到經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展乃至人類的生存問題。生物乙醇作為一種可再生的、經(jīng)濟(jì)上可承受的，并且對環(huán)境安全的能源物質(zhì)將逐漸成為石油的替代品[2]。生物乙醇的生產(chǎn)經(jīng)歷了以1代淀粉原料生產(chǎn)乙醇和以木質(zhì)纖維素為代表的非淀粉原料的2代生物乙醇工業(yè)。2代生物乙醇生產(chǎn)克服不與食品的供應(yīng)之間存在競爭，但是纖維素酶產(chǎn)量低、不穩(wěn)定、難以工業(yè)化導(dǎo)致2代生物乙醇的生產(chǎn)成本大大提高。本文從生物乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程、木質(zhì)纖維質(zhì)物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的市場前景及纖維素降解酶的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為生物乙醇生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的提升、纖維素工程菌的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

生物乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程

從上世紀(jì)80年代開始，人們就開始以谷物為原料來生產(chǎn)乙醇用作供氧燃料，這些被業(yè)內(nèi)稱為第1代燃料乙醇的原料。在一些國家，如美國、加拿大、巴西、中國等，乙醇已經(jīng)被廣泛地?fù)饺氲狡椭衼泶婕兤褪褂茫渲幸掖嫉捏w積含量可達(dá)到10%。最近美國正在實(shí)施一項(xiàng)混合燃油計(jì)劃E85，即汽車制造商生產(chǎn)一種可使用乙醇混合物E85（85% 的乙醇和15% 的汽油按體積比混合）的汽車[3]。巴西早在1929年就建立了一項(xiàng)利用乙醇作為發(fā)動(dòng)機(jī)燃料的計(jì)劃，并在接下來幾年里安裝了第一個(gè)使用乙醇作為燃料的發(fā)動(dòng)機(jī)。1984年，巴西要求新生產(chǎn)的汽車能使用水化生物乙醇（96%的生物乙醇+4%的水）作為燃料[3]。混合燃料的使用不僅可以減少汽油的使用量，還可以降低溫室效應(yīng)氣體以及有毒氣體的釋放。

但是隨著世界人口的不斷增長，以谷物等第1代淀粉原料生產(chǎn)乙醇就與食品的供應(yīng)之間存在競爭，這些谷物為原料生產(chǎn)乙醇就不能滿足全球的需求。中國在過去三十年中GDP的年平均增長量為10%，這使得中國成為世界上最大的燃料消費(fèi)國之一，同時(shí)也成為世界上造成空氣污染最嚴(yán)重的國家。由于大部分的能源由燃燒化石燃料提供，中國政府正努力解決諸如國內(nèi)因迅速枯竭的石油和天然氣資源而越來越依賴進(jìn)口石油來滿足國內(nèi)一半的實(shí)際需求[4]，以及嚴(yán)重的環(huán)境污染等問題。為了改善現(xiàn)狀，中國政府決定增加使用能源的種類，尤其提倡使用可再生的、排放更少溫室氣體的燃料，如乙醇這樣的生物燃料和生物柴油。由于生物燃料從諸如玉米、木薯、大豆這樣的農(nóng)產(chǎn)品中提取而來，這對改善中國農(nóng)村人口的經(jīng)濟(jì)狀況有積極影響。除了向乙醇生產(chǎn)者發(fā)放津貼以鼓勵(lì)乙醇的生產(chǎn)之外，中國政府近年來也強(qiáng)制要求中國十個(gè)省份必須銷售濃度為10%的乙醇汽油，這些措施使得中國2008年的乙醇產(chǎn)量迅速達(dá)到14.6億升且在2010年達(dá)到21.5億升，一舉成為繼美國和巴西之后的世界第三乙醇生產(chǎn)大國。盡管中國政府之前要求到2020年國內(nèi)乙醇的年消費(fèi)量要達(dá)到100億升，然而由于擔(dān)心乙醇生產(chǎn)可能與食物生產(chǎn)行業(yè)形成競爭，且考慮到國內(nèi)農(nóng)村可用耕地?cái)?shù)量有限，以及水資源供應(yīng)短缺的問題，中國政府于2007年宣布暫停國內(nèi)谷物乙醇的生產(chǎn)。

為了解決這個(gè)矛盾，以木質(zhì)纖維素為代表的非淀粉原料成為生物乙醇生產(chǎn)的重要原料物質(zhì)。木質(zhì)纖維素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有三種：纖維素35%～37%、半纖維(23-25%)和木質(zhì)素(18-22%)組成。每年光合可產(chǎn)生大于1，500億噸的植物干物質(zhì)，其中一半以上是纖維素和半纖維素[5]。另外，人類活動(dòng)產(chǎn)生的廢棄物中也含有大量的纖維素，如農(nóng)業(yè)廢物( 稻草、稻殼、麥稈、花生殼、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣等)、食品加工廢物(果皮、果渣等)、木材廢物(木屑、樹皮)以及城市廢棄物(40%~60% 固體廢物是垃圾和廢紙)等。如果能有效地利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將這些纖維素轉(zhuǎn)化成簡單糖，再發(fā)酵產(chǎn)生乙醇等能源物質(zhì)，不僅可以變廢為寶，而且還可以避免由于化石燃料燃燒所帶來的環(huán)境污染，更重要的是可以緩解或解決石化能源短缺乃至枯竭所帶來世界性能源危機(jī)。

木質(zhì)纖維質(zhì)物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的市場前景

到2020年，全世界從木質(zhì)纖維素物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇的產(chǎn)量大約是165億加侖（合計(jì)約625億升），美國將占有63.9%的市場，歐洲和中國分別將占有10.4%和11.5%的市場[3]。目前，生物乙醇的產(chǎn)業(yè)，尤其是非淀粉類的生物乙醇產(chǎn)業(yè)主要在于政府的補(bǔ)貼和維持，其原因在于利用木質(zhì)纖維生產(chǎn)生物乙醇的生產(chǎn)成本較高。第1代淀粉類原料與第2代非淀粉類原料發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇不同之處在于前面的預(yù)處理和酶解糖化過程。淀粉類原料很容易被酶接觸到，就被淀粉酶和糖化酶酶解為葡萄糖(C6糖)，然后葡萄糖再被普通的酵母發(fā)酵生產(chǎn)出乙醇，這樣，生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)少，流程短，成本就非常低。但是木質(zhì)纖維素物質(zhì)經(jīng)過自然選擇和漫長進(jìn)化，木質(zhì)素將半纖維素和纖維素緊密包裹在內(nèi)部，形成緊密結(jié)構(gòu)，被天然“設(shè)計(jì)”成可以抵御酶進(jìn)攻的分子結(jié)構(gòu)。因此與淀粉乙醇不同的是首先要有高溫高壓蒸汽或結(jié)合加酸堿等化學(xué)品的預(yù)處理技術(shù)將緊密結(jié)構(gòu)打開，讓酶能夠接觸到纖維素和半纖維素。纖維素和半纖維素酶解后發(fā)酵可以生產(chǎn)出乙醇[6]。纖維素酶解后可得到葡萄糖(C6糖)，半纖維素酶解后可得到木糖(C5糖)，淀粉類和纖維素都是由葡萄糖聚合成的長鏈結(jié)構(gòu)，只是結(jié)合的方式不同而已，因此酶解過程需要的酶是不同的；而半纖維素是由C5糖聚合而成的長鏈結(jié)構(gòu)，也需要特定的酶。纖維素及半纖維酶的成本更高，這也是導(dǎo)致木質(zhì)纖維素乙醇成本比淀粉乙醇高的重要原因之一。在每加侖生物乙醇的生產(chǎn)中，利用木質(zhì)纖維生產(chǎn)，纖維素酶的成本大約是15-20美分，而利用淀粉類生產(chǎn)，淀粉酶的費(fèi)用僅僅只占到了2－4美分[7]。因此要想提高纖維素生產(chǎn)生物乙醇的市場的競爭力，提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低纖維素酶的成本成為解決問題的關(guān)鍵因素。我國是纖維素酶的需求大國，由于纖維素酶的廣泛應(yīng)用，我國市場需求量將以每年25%～35%的速度上升，用纖維素酶產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)生物乙醇的關(guān)鍵技術(shù)將在未來幾年內(nèi)得到解決，那時(shí)我國纖維素酶年需求量將增加到25-40萬噸，每年將為我國節(jié)省生產(chǎn)燃料乙醇用糧500-1，000萬噸[8]。由于產(chǎn)酶菌種落后，產(chǎn)率低，成本高，嚴(yán)重影響我國纖維素酶工業(yè)發(fā)展，從而阻礙了以木質(zhì)纖維素為原料的2代生物乙醇工業(yè)的發(fā)展。

木質(zhì)纖維素及纖維素降解酶

木質(zhì)纖維素，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有三種：纖維素(35%～37%)、半纖維(23%-25%)和木質(zhì)素(18%-22%)組成[9]。纖維素屬于可再生自然資源，是生物界最重要的碳源物質(zhì)，每年由光合作用產(chǎn)生的植物干質(zhì)量約1，500億噸，其中纖維素占850億噸[5]。

纖維素酶(cellulase)是指能夠水解纖維素β-1，4-D-葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱。纖維素酶是一種具有很高活力的木聚糖酶，是一種復(fù)合酶，屬生物催化劑[10]。纖維素酶主要是指三類關(guān)鍵酶:（1）外切型纖維素酶，系統(tǒng)命名為外切β-1，4-D-葡聚糖酶，又稱纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91，也稱Cl酶)。這類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4-糖苷鍵，每回依次從纖維素分子中切下一個(gè)纖維二糖分子，所以又稱纖維二糖水解酶(簡稱CBH)。（2）內(nèi)切型纖維素酶，系統(tǒng)命名為內(nèi)切β-l，4-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也稱Cx酶或CMCase)。這類酶是纖維素酶中最重要的酶，它作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量帶有非還原末端的小分子纖維素。（3）纖維二糖酶，系統(tǒng)命名為β-葡萄糖苷酶(EC2.1.21，也稱CB酶)，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。當(dāng)以上三種纖維素酶的關(guān)鍵酶的活性比例適當(dāng)時(shí)，就能協(xié)同作用完成對纖維素的降解，但各個(gè)酶組分單獨(dú)作用時(shí)效果極差。所以說纖維素酶降解纖維素時(shí)一個(gè)協(xié)同表達(dá)和作用的過程[11-12]。

不同來源的纖維素酶分子特征和催化活性都不盡相同。細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶量少，主要是內(nèi)切酶，大多數(shù)對結(jié)晶纖維素沒有活性，而且不能分泌到細(xì)菌細(xì)胞外，常常聚集形成多酶復(fù)合體[13]。真菌能產(chǎn)生大量的纖維素酶，產(chǎn)生的酶組分，能分泌到菌體外，一般不聚集成多酶復(fù)合體，但可以相互發(fā)生強(qiáng)烈的協(xié)同作用。纖維素酶分子的大小因來源不同也有明顯的差異，變化范圍很廣。多數(shù)真菌和少數(shù)細(xì)菌的纖維素酶都受到糖基化，所含碳水化合物的比率不同在很大程度上決定了酶的多型性，表現(xiàn)為分子量的差別[14]。纖維素酶的酶活力一般都很低，因而酶生產(chǎn)成本高。據(jù)報(bào)道，纖維素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相應(yīng)水解所需的大100倍，這是影響纖維素酶實(shí)際應(yīng)用的重要原因之一[3]。

迄今為止，人們已從40多種細(xì)菌和數(shù)種真菌中克隆到了多種纖維素酶基因，有一百多種基因可在大腸桿菌中表達(dá)，大多數(shù)克隆的纖維素酶基因能產(chǎn)生信號肽，從而使表達(dá)產(chǎn)物部分或全部轉(zhuǎn)移至E.coli的細(xì)胞質(zhì)間隙[15]。雖然克隆到大腸桿菌的基因，不需要載體的啟動(dòng)子就可表達(dá)，但表達(dá)水平很低，推測可能是其啟動(dòng)子不能完全被識別的緣故。但在大腸桿菌中表達(dá)纖維素酶基因存在兩個(gè)主要問題:一是提取有很大困難，二是表達(dá)水平低、酶蛋白不能分泌，離工業(yè)化應(yīng)用的目標(biāo)還有一定的距離，所以在纖維素酶基因的表達(dá)方面人們將目光轉(zhuǎn)向了真核表達(dá)系統(tǒng)[16]。

木霉屬是研究最廣泛的纖維素酶產(chǎn)生菌[6]，世界纖維素酶市場中的纖維素酶20%是來自木霉屬和曲霉屬[17]。綠色木霉是一種在各種氣候帶的土壤中能夠普遍存在的一種多細(xì)胞絲狀真菌，能夠分泌完全的纖維素酶系，其中產(chǎn)量較高并且穩(wěn)定，是目前纖維素酶商業(yè)化生產(chǎn)的主要生產(chǎn)菌株[18]。對于綠色木霉的研究直到九十年代初僅有CBHⅠ基因克隆的報(bào)道，王建榮、張曼夫利用里氏木霉的基因序列同源片段做探針，構(gòu)建了綠色木霉基因文庫，并克隆了CBHⅠ、CBHⅡ基因，并對其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究[19]。

纖維素酶的合成一般受纖維素誘導(dǎo)及葡萄糖降解物的阻遏，多數(shù)菌株纖維素酶的合成既受纖維二糖、山梨糖等的誘導(dǎo)，又為葡萄糖、甘油等易利用碳源的阻遏，還受菌體生長速度的影響[6]。在綠色木霉中，纖維素酶屬誘導(dǎo)型酶類，其多個(gè)酶組分的表達(dá)經(jīng)過嚴(yán)密的調(diào)控。在綠色木霉中能產(chǎn)生分泌型的纖維素酶，當(dāng)CBHⅡ基因缺失時(shí)，會(huì)影響纖維素酶系其他酶的表達(dá)，而缺失其他基因時(shí)，只單獨(dú)影響自身的表達(dá)。另有研究表明CBHⅡ是纖維素酶系統(tǒng)中最先表達(dá)的酶，其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)一步誘導(dǎo)其他纖維素酶基因的表達(dá)，但CBHⅡ基因的表達(dá)受纖維素降解產(chǎn)物葡萄糖的抑制[20]。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，定點(diǎn)突變和基因重排技術(shù)在纖維素酶的生產(chǎn)工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛。在里氏木霉 (T.reesei) 中，需要產(chǎn)生至少14種酶協(xié)同作用才能水解未經(jīng)化學(xué)處理過的植物干物質(zhì)。為了降低纖維素酶的復(fù)雜性，將里氏木霉的CBH1、嗜酸耐熱菌的葡聚糖內(nèi)切酶EI 以及曲霉(Aspergillus niger)的β- 葡萄糖苷酶以90∶9∶1(質(zhì)量比)混合形成一個(gè)三元復(fù)合物，此三元復(fù)合物在120 小時(shí)內(nèi)水解預(yù)處理過的纖維素的能力與李氏木霉中纖維素酶體的水解能力相當(dāng)。為了提高此三元復(fù)合物水解纖維素的活力，利用定點(diǎn)突變的方法對葡聚糖內(nèi)切酶EI的活性位點(diǎn)進(jìn)行修飾，結(jié)果與突變前的三元復(fù)合物相比，其水解纖維素的活性提高了12%[21]。Zinnia R等在里氏木霉菌中應(yīng)用同源重組技術(shù)將外切β－葡萄糖苷酶整合到egl3和xyn3基因啟動(dòng)子的下游，增強(qiáng)了纖維素酶的表達(dá)量4倍到7.5倍，這些重組菌株能有效的降解纖維素物質(zhì)[22]。

生物乙醇及纖維素降解酶的未來發(fā)展趨勢

隨著石化燃料供應(yīng)的減少，尋找新的能量來源關(guān)系到經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展乃至人類的生存問題。生物乙醇作為一種可再生的、經(jīng)濟(jì)上可承受的，并且對環(huán)境安全的能源物質(zhì)將逐漸成為石油的替代品[2]。由于產(chǎn)酶菌種落后，產(chǎn)率低，成本高，嚴(yán)重影響我國纖維素酶工業(yè)發(fā)展，從而阻礙了以木質(zhì)纖維素為原料的2代生物乙醇工業(yè)的發(fā)展。因此要想提高纖維素生產(chǎn)生物乙醇的市場的競爭力，提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低纖維素酶的成本成為解決問題的關(guān)鍵因素。目前纖維素酶工程菌株中不穩(wěn)定、產(chǎn)酶量不高、難應(yīng)用于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等三大難題。利用基因工程技術(shù)改造菌種，尤其是纖維素酶基因啟動(dòng)子的改造，在發(fā)酵過程中其酶形成過程不受主要代謝產(chǎn)物葡萄糖的抑制，促進(jìn)其他纖維素酶基因的協(xié)同表達(dá)，大幅度提高菌株在發(fā)酵過程中的產(chǎn)纖維素酶的能力，將是工程菌柱構(gòu)建的方向，構(gòu)建不受葡萄糖抑制、穩(wěn)定、高效的表達(dá)纖維素酶工程菌。可以解決本項(xiàng)目的實(shí)施將會(huì)大大提高纖維素酶的產(chǎn)量，降低木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇時(shí)纖維素降解成本，從而促進(jìn)木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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