燕麥種質資源遺傳多樣性ISSR研究

劉歡，慕平，趙桂琴＊

（1.甘肅農業大學草業學院 草業生態系統教育部重點實驗室 中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州730070）

燕麥（Avena）屬禾本科（Gramineae）、燕麥族（Aveneae）、燕麥屬（Avena），是世界各地廣泛栽培種植的一種重要糧食兼飼草、飼料作物［1］。燕麥具有抗旱、耐冷、耐瘠薄等優良性狀和很高的營養及保健價值，主要栽培種分為有稃和裸粒兩大類型。世界各國以有稃型為主，其中最主要的是普通栽培燕麥，又稱飼用燕麥（A.sativa），而我國是裸燕麥（A.nuda）的起源中心，裸燕麥產量約占燕麥總產量的90%以上［2］。

我國燕麥盡管栽培歷史悠久，但對燕麥的研究主要側重于燕麥栽培、引種、生產性能比較等方面［3－5］。目前，我國對燕麥種質資源的分子遺傳學研究還遠不夠完善，主要借助于同功酶等生化標記方法［6，7］，在國內外有利用RAPD（randomly amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性 DNA）、RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段長度多態性）以及 AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性）等分子標記對燕麥遺傳差異、品種鑒定和圖譜構建等方面進行研究，但利用ISSR（inter－simple sequence repeats，簡單重復序列區間）標記法研究燕麥遺傳多樣性尚未見報道［8－12］。

遺傳多樣性不僅表現在表型性狀上的差別，更重要的是表現在蛋白質、染色體和DNA水平上的差異。分子標記的發展為從DNA水平檢測品種及品系間的遺傳多樣性提供了有利的工具。ISSR技術是由Zietkiewicz等［13］創建的一種新型的微衛星類分子標記技術，其采用錨定SSR（simple sequence repeats，簡單重復序列）策略，對簡單重復序列間的遺傳信息進行多態性擴增。ISSR綜合了其他分子標記高多態性、可重復性、低成本易操作以及無需知道基因組序列優點，目前已廣泛應用于多種作物和部分牧草的品種鑒定、系統分類、遺傳多樣性檢測、基因定位和遺傳圖譜構建等研究中［14－16］。因此，本研究利用ISSR標記方法對所收集的48份國內外主要燕麥栽培品種進行遺傳多樣性和親緣關系分析，研究不同品種之間的遺傳差異，分析其遺傳背景，為燕麥的遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料選用來自中國、日本、加拿大、澳大利亞和歐洲等不同國家和地區的42個飼用燕麥及6個裸燕麥品種，具體來源見表1。

1.2 基因組DNA提取

參試資源材料于培養皿中播種，室溫下25～30℃，出苗后8～10d（材料預處理：供試植株暗培養2～3d），每份材料隨機取10～15個單株的幼嫩葉片0.5g，等量混合，采用改良CTAB（cetyl triethyl ammonium bromide）法提取植物總 DNA［17］。

表1 試驗材料及其來源Table 1 Materials and sources

續表1 Continued

1.3 燕麥ISSR反應體系的優化建立及引物篩選

ISSR引物是根據加拿大哥倫比亞大學公布的100個引物序列，選出48個交由上海生工合成，進一步篩選引物用于燕麥ISSR。將篩選引物分別在小麥（Triticumaestivum）［18］、野生大麥（Hordeumvulgare）［19］和烏拉爾甘草 （Glycyrrhizauralensis）［20］的ISSR反應體系和反應程序下進行擴增，通過預試驗，建立了一套燕麥ISSR分析的優化反應體系及反應程序。即：25μL反應體系中含有，18.3μL ddH2O，2.5μL 10×buffer，2.0μmol／L Mg2＋，250μmol／L dNTP，1.5UTaqDNA聚合酶，0.3μmol／L引物，10ng DNA 模板。反應程序為：94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共34個循環；72℃延伸5min，4℃保溫。

1.4 PCR擴增及電泳檢測

PCR擴增在Thermo Hybaid PCR儀上進行。擴增產物在8%變性聚丙烯酰胺凝膠40W 恒功率電泳。采用Brant銀染法進行顯色觀察［21］，膠版干后掃描拍照、統計數據。

1.5 數據統計及分析

ISSR通常被認為是顯性標記，同一對引物組合擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性，按照相同移位上有擴增帶記為1，無帶的記為0的方法記錄清晰電泳譜帶，得到的ISSR表型數據矩陣。用NTSYS 2.1及Genepop軟件進行數據處理，采用Nei（1987）方法計算遺傳相似系數（genetic similarity）GS＝2Nij／（Ni＋Nj），式中，Ni和Nj分別為i和j兩材料的總等位位點數，Nij為i和j兩材料的共有等位位點數。遺傳距離（genetic distance）GD＝1－GS。利用GD值按非加權成對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，建立樹狀圖［22］。

表2 8個ISSR引物對48份燕麥基因組DNA擴增結果Table 2 The result of ISSR fragments amplified with 8primers in 48oats

2 結果與分析

2.1 燕麥ISSR引物篩選

燕麥ISSR反應體系的構建最終借鑒了小麥ISSR研究，經反復試驗摸索出了效果較好的PCR擴增體系，并從48個引物中篩選出8個重復性好，特異性高，擴增效果好，電泳圖清晰的引物（表2），擴增片段的長度在200～2 000bp，共獲得清晰可見帶144條，其中多態帶126條，平均每個引物產生18條帶，平均多態性檢出率為86.1%，說明供試燕麥種質間有較高等位多態性，這些多態性多來自外部種質的引進或育種親本的選擇，可檢測出變種間及種內各品種間的變異。

ISSR鑒定標記在所用的ISSR引物中，以引物UBC845和UBC844區分48個材料的效果較為明顯，即使是親緣關系很近的材料，也可根據其指紋將其分開（圖1）。如親緣關系很近的青引1號和青引2號品種在2個引物的擴增圖譜上都有各自的特異性條帶；而所有皮燕麥品種在450bp處均比裸燕麥品種多出1條多態帶，這說明ISSR標記在燕麥指紋圖譜建立和種間及種內鑒定中具有較好的效果。

圖1 引物 UBC 845（上圖）、UBC 844（下圖）擴增的燕麥ISSR圖譜（PAGE）Fig.1 ISSR profile of oat with primer UBC 845（upper figure）and UBC 844（below figure），respectively（PAGE）

不同的引物對燕麥的擴增效果差別較大，8個篩選出的引物中，有7個二核苷酸重復序列，1個四核苷酸重復序列，說明在植物中二核苷酸微衛星比三核苷酸和四核苷酸微衛星更普遍，其中2個（CT）n重復序列引物為UBC 845和UBC 844，其多態性比率分別達88.4%和88.0%，且擴增譜帶最為清晰（圖1）。所以在燕麥ISSR研究中，設計二核苷酸引物更好些，且燕麥基因組中（CT）n重復序列較多。盡管（AT）n在植物中含量最多，但所篩引物中并無含（AT）n引物，說明這樣的引物容易自連導致不能擴增出條帶。

2.2 燕麥品種的聚類分析

Nei相似系數是用來比較群體或個體間相似程度的度量參數，平均相似系數越高，說明相似程度越大，遺傳背景一致性越強［22］。48個燕麥品種間遺傳相似系數均在0.58以上，最高為0.941 7（青選18和316），最低為0.583 3（加拿大裸燕麥VOA－3和蒙古皮燕麥57），遺傳相似系數變幅較大，主要是由于皮燕麥與裸燕麥之間差異較大。品種間的遺傳距離變化為0.060 1～0.539 0。

按UPGMA方法進行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖（圖2）。結果表明，利用ISSR標記能將48份燕麥完全區分開。在遺傳相似系數為0.66處，42個皮燕麥品種與6個裸燕麥品種明顯分為2類，這說明ISSR標記種間或亞種間的界線十分明顯。供試品種以遺傳相似系數0.783為分類界限，聚為5類：第Ⅰ類由20個品種組成，來自我國青海和湖北的皮燕麥品種青引1號、青引2號、249、冀引1號、加拿大品種Ronald為第1亞類；巴燕3號、黃燕麥、甜燕麥為第2亞類；吉林品種白燕7號獨自歸為一亞類。青選18、316、青96、青198、181、青30、237、青252、304、青97、709為第4亞類，此亞類多數為我國青海品種，此外有3個品種分別來自俄羅斯、瑞典和芬蘭。第Ⅱ類由19個品種組成，多數都是國外品種，又分為4個亞類，第1亞類包括4628、4607、4617、4632、Calibre、CNC、科燕1號、AC－1131、AC－1038、4641、4609；其中除科燕1號外，均為加拿大品種；第2亞類包括澳大利亞品種Blackbutt、丹麥品種444；第3亞類包括蒙古品種57、俄羅斯品種474和28、英國品種353、歐洲品種53；日本品種初島獨自歸為一亞類。第Ⅲ類僅有2個品種，即98AS1302、美國石燕麥，且二者各歸為一個亞類。四川品種Y61－005與其他材料間的遺傳分化最大，單獨聚為一類（第Ⅳ類）；以上四大類所有品種均為皮燕麥，而第Ⅴ類則包括全部裸燕麥品種。

圖2 燕麥48個品種基于ISSR的遺傳相似性UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 48oat cultivars

聚類結果表明，皮燕麥與裸燕麥的遺傳距離在0.58～0.76，在聚類樹狀圖上分為兩大類，進一步證實了當今的燕麥分類系統中皮燕麥與裸燕麥分別為燕麥屬的2個種的分類情況。48個燕麥品種所分的五大類可能分屬六倍體燕麥（2n＝6x＝42）種群中具有AACCDD染色體組的不同種，或是同一種中由于地理位置造成的遠緣關系。我國的幾個皮燕麥品種聚為第Ⅰ大類，這些品種遺傳關系較近，遺傳資源基礎狹窄，加拿大品種Ronald與青引1號、青引2號、249、冀引1號歸為一亞類，證明我國多數皮燕麥品種為引進品種，且這幾個品種與Ronald親緣關系較近，但這些品種是否引自Ronald則無法斷定。第Ⅰ類第2亞類中的高產且適應性強的新品種巴燕3號與甘肅、青海的地方品種黃燕麥間的遺傳相似度極高，為0.925 0，這與AFLP標記對燕麥遺傳多樣性研究中分析的2個品種遺傳相似度為0.988 1的結果極為相似，且聚類結果完全一致，進一步證明了黃燕麥是巴燕3號的雜交親本之一，且說明ISSR和AFLP標記均是品種遺傳關系鑒定的可靠方法。在48個燕麥種質中，川草四號（Y61－005）燕麥表現出了特異性，與其他種質的遺傳距離遠，單獨聚為第Ⅳ類。其粒色深棕，籽粒細小紡錘形，發芽率極低，應對種質性狀和遺傳特性進行進一步研究。從圖中可以看出，加拿大、澳大利亞皮燕麥品種的遺傳多樣性稍高于我國燕麥品種，而美國皮燕麥品種單獨歸為不同亞類，證明其遺傳背景相對復雜，多樣性水平極高。供試國內外裸燕麥品種遺傳相似度在0.808 3～0.933 3，都表現為近緣關系，進一步證實了裸燕麥的中心起源說。

本研究還利用Popgen32軟件中的Shannon’s信息指數和Nei’s指數分別估計了群體的遺傳變異。供試品種平均變異為0.231 3，平均Shannon’s信息指數估計值為0.369 0。42個皮燕麥品種的平均變異為0.203 6，平均Shannon’s信息指數估計值為0.325 9；6個裸燕麥品種的平均變異為0.201 5，平均Shannon’s信息指數估計值為0.305 8。可見，皮燕麥的遺傳多樣性高于裸燕麥。

2.3 燕麥品種的主成分分析

對48份燕麥種質的ISSR標記的原始矩陣進行主成分分析，并根據第1、第2主成分進行作圖，所形成的各燕麥材料的位置分布如圖3所示，位置相靠近者表示關系密切，遠離者表示關系疏遠。

將位置靠近的燕麥材料劃歸在一起，可將供試材料分成5個組，結果表明，主成分分析結果與聚類分析結果基本一致，在聚類圖中各品種間的遺傳多樣性較高，因此主成分分析圖中個別品種也較為分散，主成分分析結果更直觀地表明了不同燕麥材料之間的親緣關系。

圖3 燕麥48個品種基于ISSR表型的PCA分析Fig.3 The principal－coordinate analysis based on ISSR patterns among 48oat cultivars

3 討論

3.1 燕麥遺傳多樣性的ISSR檢測

本研究是利用ISSR技術來研究國內外燕麥品種的遺傳多樣性，通過PCR擴增的多態性差異所統計的遺傳相似系數，能反應不同材料間的遺傳距離及關系，也可以作為遺傳育種的輔助手段，對雜交品種的選育和育成品種的雜種優勢進行初步估測，提高育種效率。試驗中8個ISSR標記在48份燕麥材料中共產生144條擴增帶，其中86.1%的擴增片段能夠揭示材料間的遺傳差異，表明燕麥品種間遺傳相似系數和遺傳距離的變化范圍很大，具有豐富的遺傳基礎。這一點在國內外多種分子標記對燕麥種質資源的相關研究中都得到驗證，這些標記都能產生各自有效的多態性條帶，但多態性水平和檢測水平各不相同。如王茅雁和齊秀麗［7］利用RAPD標記對我國21份燕麥材料的遺傳差異及類群劃分的研究中，22個多態性引物共擴增出114條帶，其中85.1%具有多態性。O’Donoughue等［23］根據RFLPs對北美83份栽培燕麥和大麥品種進行了遺傳分析和品種鑒定，46個cDNA多態性克隆檢測到278條帶，其中73.7%是多態性帶。Pal和Sandhu［24］用RFLP分析燕麥屬13個種間存在41%的多態性。Li等［25］用SSR對燕麥建立遺傳圖譜，研究表明44條引物中62%的引物能夠檢測燕麥種間的多態性，36%能夠檢測燕麥品種間的多態性，品種間多態帶比率為57%。劉歡等［10］采用AFLP分析42份燕麥材料遺傳多樣性，篩選出的5對引物組合共獲得268條帶，平均多態性檢出率為69.0%。這些差異可能是由于材料選擇和研究方法的不同造成的。此外，ISSR標記每一個簡并堿基代表2～3個堿基，提供了許多機會被不同的基因組篩選。因而，同一套引物可以用于不同的物種，而且ISSR可以更好地揭示物種間的多態性。本研究發現燕麥ISSR的多態性極高，但其ISSR引物的有效數目遠遠低于水稻 （Oryzasativa）和小麥，48條ISSR引物，僅有8條引物（占16.7%）能夠得到清晰擴增產物。而在小麥中，Nagaoka和Ogihara［26］發現100條ISSR引物中33條（占33%）能產生清晰的擴增產物；Joshi等［27］在水稻ISSR研究中發現60%的引物能產生清晰條帶。這可能是由于物種的基因型差異所致。在檢測技術上，本研究采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，相比較常規的瓊脂糖凝膠電泳而言，操作過程稍顯復雜，但分離小片段DNA效果好，分辨率極高，PCR擴增所得產物在200～2 000bp，基因型間的差異僅為幾個bp，且無需采用有毒性的溴化乙錠染色，用銀染法即可得到清晰、重復性好而多態性高的電泳圖譜，進一步增加了試驗結果的穩定性和可靠性。綜合分析，利用ISSR可以獲得清晰且多態性高的燕麥電泳圖譜，該技術比RFLP、SSR、RAPD等技術更多地揭示基因組中的多態性，可應用于大批量樣品的研究，應用于燕麥遺傳多樣性研究及不同材料的DNA水平識別也是可靠的。另外，燕麥是自花授粉植物，利用ISSR標記分析的準確性明顯高于異花授粉植物，只要選擇足夠多且具有代表性的種、亞種、類型進行深入研究，可以在分析親緣關系、研究系統發育、種質資源利用等方面發揮重要作用。

當然ISSR技術也存在著一些不足。例如用ISSR標記數據計算遺傳相似系數時可能會出現偏差，因為它同樣可能像RAPD那樣在一個位置上出現的條帶并不是來自基因組上的同一區域，只不過正好碰巧片段長度相等［28］。此外，ISSR大部分情況下是顯性標記，不能區分純合體與雜合體，進行兩倍體或多倍體物種的種群多樣性研究時，數據分析方法還需不斷改進［29］。

3.2 燕麥遺傳多樣性與其地理來源的關系

試驗選取來自中國、加拿大、美國、澳大利亞、歐洲、日本、烏克蘭等不同國家和地區的燕麥品種，這些品種遺傳多樣性豐富，遺傳背景差異相對顯著，可以直接應用到以后的雜交優勢親本選育中去。ISSR分析結果從DNA水平揭示品種間的差異和相關性，基于ISSR水平的聚類分析及主成分分析結果與品種的地域來源表現較強的相關性，遺傳距離與地理分布關系密切，各國或不同地理區間的ISSR變異較大，各品種間差異較明顯，歐氏距離相差大；而來自同一國家的品種間遺傳差異并不明顯，以美國品種的遺傳多樣性最高，與其遺傳距離最近品種間遺傳相似系數為0.783 3；加拿大、歐洲及中國品種的遺傳多樣性指數都相對較低，我國供試的16個皮燕麥品種遺傳相似系數極高，在0.841 7～0.933 3，說明國內品種間差異小。原因可能是美國地理氣候條件豐富，燕麥的起源和進化狀況差異較大，育種手段和研究方法多樣，故遺傳多樣性較明顯。而其他幾個國家及地區地理氣候條件相近，育種方法單一，此方面研究稍微落后，故燕麥遺傳差異相對較小。ISSR在一定程度上能較好的反映出燕麥品種間親緣關系的遠近。從聚類圖可以得出兩點，一個是屬于同種、同組的不同材料首先聚在一起，然后再與其他組的材料聚在一起，另外一點表現為明顯的地域規律，即地理來源相同的材料首先聚在一起。我國的多數皮燕麥品種都聚在第Ⅰ大類，其中青海的多數品種、甘肅品種為一亞類，吉林的品種單獨歸為一亞類；第Ⅱ大類多數由國外皮燕麥品種組成，其中第1亞類中除科燕1號外，均為加拿大品種，澳大利亞、丹麥品種為一亞類，蒙古、俄羅斯、歐洲品種也歸為同一亞類，日本品種初島獨自歸為一亞類；第Ⅲ大類包括加拿大、美國的2個品種；第Ⅳ類為我國四川品種，而第Ⅴ類則包括全部裸燕麥品種。這一結果與范彥等［30］的研究結果相似，即地理位置近的具有首先聚在一類的趨勢，品種（系）間呈現出一定的地域性分布規律。但孫群等［31］研究結果表明烏拉爾甘草組群的劃分與其生態地域性沒有明顯關系，認為樣品間遺傳差異與形態、地理來源差異沒有必然的聯系。聚類圖中可看出有些品種并未與同一地區或具有親緣關系的品種聚為一類，這可能是由于選育過程中存在相互引種的關系，或是多個親本復合雜交以及多向選擇產生了較大的遺傳變異所致。也可能是由于長期種植后，自然條件及栽培環境等的變化所產生的基因變異，種質的相互滲透而形成。

供試6個裸燕麥品種遺傳相似度在0.808 3～0.933 3，加拿大裸燕麥品種與其他中國品種遺傳相似度平均保持在0.83，與吉林裸燕麥遺傳距離最近，因為吉林的裸燕麥大多來源于加拿大；我國被認為是裸燕麥的起源中心，供試的5個國內裸燕麥品種遺傳相似系數在0.850 0～0.933 3，其中定西、內蒙古品種遺傳距離較近，其次是山西品種，吉林品種與其余幾省的品種遺傳距離相對較遠，表明我國燕麥地方品種遺傳基礎廣闊，在基因型表現特異性的同時又有較強的地域性。

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