高精料誘導的SARA對泌乳期山羊血液和瘤胃液中皮質醇的影響

賈媛媛，王紹慶，常廣軍，張源淑，莊蘇，倪迎冬，沈向真，陳杰，趙茹茜

（南京農業大學動物醫學院 農業部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京210095）

隨著我國人民生活水平的改善，奶業在整個國民經濟中的地位日益提高。但是，以秸稈為主要粗飼料時，大量飼喂高精料雖然在一定程度上提高了反芻動物的生產性能，卻極易引發瘤胃亞急性酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）。SARA是一種常見的代謝性疾病［1］，商業化奶牛養殖場中，有20%以上的奶牛在泌乳早期和泌乳中期患有SARA［2］，并且發病率呈逐年上升趨勢，造成了極大的經濟損失［3］。SARA發生時瘤胃酸度和細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）濃度顯著增加，嚴重感染受損的瘤胃上皮［4，5］，LPS發生移位進入血液，形成內毒素血癥［6，7］，引發全身性炎癥反應［8］。此外，機體免疫系統遭到損害，使動物處于一種慢性應激狀態。目前，國內外對SARA的研究多集中于瘤胃發酵模式和血液參數的改變，對應激反應的研究較少。Steiger等［9］和Waldron等［10］的相關研究指出，奶牛注射LPS后免疫細胞所釋放的細胞因子最終能激活下丘腦－垂體－腎上腺軸（hypothalamie－pituitary－adrenalaxis，HPA）。Niel等［11］研究表明，綿羊注射IL－6后外周血中促腎上腺皮質激素和皮質醇濃度均顯著升高，并將這2項指標作為HPA軸激活的標志。糖皮質激素是體內重要的應激和代謝激素，對機體在正常和應激，包括疾病和炎癥狀態下營養的重分配，能量平衡的維持以及在逆境下的生存起決定性的作用［12，13］。肝臟作為機體重要的代謝器官，肝臟上存在高豐度表達的糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR），能夠接受糖皮質激素的信息并做出適應調節［14］。但SARA狀態下HPA軸是否被激活及受體是否改變卻鮮有報道。本研究旨在模擬實際生產中的飼喂模式，通過添加高精料日糧誘導亞急性瘤胃酸中毒，初步揭示SARA時機體的應激反應狀態及肝臟上糖皮質激素受體基因表達的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養

選用健康狀況良好、體重15～20kg的泌乳中期山羊（波爾山羊與浙江麗水本地山羊雜交后代）7只，手術安裝永久性瘤胃瘺管，恢復期為14d，2010年12月－2011年2月飼養于南京農業大學實驗動物房，單籠飼養，隨機分為2組，分別飼喂精粗比為4∶6和6∶4的日糧，自由飲水。

1.2 試驗設計

本試驗采用2×2拉丁方設計，隨機分為2組（分別為3和4只），分別飼喂精粗比4∶6（對照組）和6∶4（SARA組）日糧（由羊草、苜蓿草和精料組成），粗料由20%苜蓿草和80%羊草組成，配方詳見表1。2組日糧總能量和總蛋白含量相等。試驗分為2期，每期包括適應期14d和采樣期5d（適應期和采樣期都飼喂相同的試驗日糧），第1期采樣結束后調換日糧。每日08：00和20：00各擠奶1次。

1.3 樣品采集處理與分析測定

1.3.1 瘤胃液采集和處理 采樣當天，于飼喂前0 h，以及飼喂后1，2，4，6和10h通過瘤胃瘺管采集瘤胃液10mL（經孔徑為0.15mm尼龍絹過濾），立即測定pH，然后裝入塑料離心管中，在4℃條件下，1 900 r／min離心30min，取上清，－20℃保存。

1.3.2 血液采集和處理 采樣前2d，在山羊頸靜脈處安裝血管瘺。分別于飼喂前0h、飼喂后6h經頸靜脈血管瘺采集血液，裝入肝素鈉真空離心管中，4℃，3 500r／min離心15min，收集血漿，－20℃保存。

1.3.3 肝臟RNA的提取及 Real－time PCR 肝臟活體采樣，利用TRIZOL一步法提取肝臟樣品總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA的濃度和純度（OD260／280），變性瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA質量，－70℃保存備用。反轉錄酶體系及Tap酶為Promega產品，SYBR Green購自TaKaRa公司。GR和β－actin引物采用Primer 5.0軟件自行設計，由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列見表2。

表1 試驗精料日糧組成Table 1 Composition of experimental diets

表2 目的基因引物序列Table 2 The primer sequences of the target genes

1.4 測定指標

瘤胃液、血液內LPS采用ELISA法測定，按試劑盒說明書操作進行，標準方程分別為：Y＝297.6 X＋14.52，R2＝0.994；Y＝301.1 X＋13.59，R2＝0.994，式中，X表示各樣品所測 OD值，Y表示各樣品對應 LPS含量（EU／L），R表示相關系數，LPS試劑盒購于上海朗頓生物科技有限公司。瘤胃液內乳酸用比色法測定［15，16］，乳酸濃度＝（樣品OD值－空白OD值）×標準品濃度／（標準品OD值－空白OD值），乳酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所。血漿、瘤胃液皮質醇濃度采用放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）法測定，測定方法按放免檢測藥盒說明書進行，試劑盒購于北京北方生物技術研究所。以上試驗均重復2次。

1.5 數據統計與分析

數據采用SPSS 17.0軟件進行單變量雙因素分析，主效應分別為日糧處理和采樣時間；用ANOVA進行方差分析，采用多項式比較分析日糧處理的效應。

2 結果與分析

2.1 不同精粗比日糧對瘤胃液pH的影響

2種日糧飼喂條件下，瘤胃液pH動態變化趨勢基本一致（圖1）。瘤胃液pH在飼喂前最高，飼喂后隨時間延長，pH逐漸下降，隨后由于瘤胃本身的緩沖能力pH又逐漸上升。其中，SARA組山羊在飼喂后1h，pH開始低于5.8，一直持續到6h。飼喂后6hSARA組山羊瘤胃液pH顯著低于對照組（P＜0.05），飼喂后1，2和4hSARA組山羊瘤胃液pH極顯著低于對照組（P＜0.01）。日糧類型以及日糧類型與發酵時間互作效應對瘤胃pH有顯著影響（P＜0.05）。

2.2 不同精粗比日糧對瘤胃液和血漿中LPS含量的影響

飼喂后山羊瘤胃液內LPS濃度隨時間變化呈現上升趨勢（P＜0.1）（圖2A），但同一時間點相比2組間無顯著性差異（P＞0.05）。采用雙因子分析日糧類型和發酵時間兩因素間的主效應關系，結果發現日糧類型對瘤胃液內LPS濃度有顯著性影響（P＜0.05），但日糧類型與發酵時間之間無互作效應（P＞0.05）。采食前和采食后6h血漿中LPS濃度也發生改變，日糧類型對血液LPS濃度產生顯著性影響（P＜0.05）（圖2B），0和6hSARA組血漿內LPS濃度均顯著高于對照組（P＜0.05），但日糧類型和發酵時間之間無交互效應（P＞0.05）。

圖1 不同精粗比日糧對瘤胃液pH的影響Fig.1 Effects of different crude ratio diets on pH values in rumen fluid

圖2 不同精粗比日糧對瘤胃液（A）和血漿（B）中LPS含量的影響Fig.2 Effect of different crude ratio diets on LPS content in rumen fluid（A）and plasma（B）

2.3 不同精粗比日糧對瘤胃內乳酸的影響

山羊瘤胃液中乳酸含量較低，均小于1 mmol／L（圖3）。采食前SARA組山羊瘤胃液中乳酸濃度顯著高于對照組（P＜0.05），采食后0～4h乳酸含量下降，4h時顯著高于對照組（P＜0.05），6～10h時逐漸增加并極顯著高于對照組（P＜0.01）。然而，對照組乳酸濃度在采食后1h顯著性上升（P＜0.05），采食后2～6h乳酸濃度又急劇下降。采用雙因素方差分析顯示，日糧類型以及日糧類型和發酵時間交互作用對乳酸濃度具有極顯著效應（P＜0.01）。

圖3 不同精粗比日糧對瘤胃內乳酸的影響Fig.3 Effect of different crude ratio diets on lactate concentrations in rumen fluid

2.4 不同日糧精粗比對皮質醇濃度的影響

與對照組相比，SARA組山羊采食前血液中皮質醇濃度有升高的趨勢（P＝0.05，n＝7）（圖4A），采食后6h兩組間差異不顯著（P＞0.05）。采食后0～6h期間，SARA組山羊瘤胃液皮質醇濃度呈逐漸上升的趨勢（圖4B），采食后6h達最高水平，10h時基本恢復至采食前水平，并且在采食后2，4和6h分別顯著高于對照組（P＜0.05，n＝7）。在瘤胃液中皮質醇濃度上，日糧類型對其具有極顯著影響（P＝0.006），發酵時間具有顯著性影響（P＝0.03），日糧類型和發酵時間之間有互作的趨勢（P＝0.063）。

圖4 不同精粗比日糧對血漿（A）和瘤胃液（B）內皮質醇濃度的影響Fig.4 Effect of different crude ratio diets on cortisol concentrations in plasma（A）and rumen fluid（B）

2.5 不同精粗比日糧對肝臟GR mRNA表達的影響

與對照組相比，飼喂日糧精粗比6∶4的SARA組山羊肝臟在GR mRNA表達上表現出顯著性下調（P＜0.05）（圖5）。

圖5 不同精粗比日糧對肝臟GR mRNA表達的影響Fig.5 Effect of different crude ratio diets on GR mRNA expression in liver

3 討論

3.1 不同精粗比對乳酸和pH的影響

SARA是指反芻動物采食過多谷物類易發酵碳水化合物飼料，導致瘤胃長時間處于低pH值狀態，并伴隨少量乳酸積累的一種代謝性疾病［17，18］。目前，研究者已將瘤胃pH值作為衡量SARA發生與否的最有效指標。Yang和Beauchemin［19］認為可以把瘤胃pH值低于5.8作為衡量SARA發生的臨界pH值。本研究顯示，與飼喂精粗比4∶6日糧相比，飼喂精粗比6∶4日糧2周后的山羊瘤胃液pH值在飼喂后1h開始低于5.8，并一直持續6h后才緩慢上升，試驗后期動物出現厭食、精神萎靡等典型的亞急性酸中毒癥狀，從而表明本試驗已成功誘導泌乳期山羊亞急性瘤胃酸中毒。

目前有關反芻動物在SARA期間瘤胃內是否存在乳酸以及乳酸含量的范圍尚不清楚。Krause和Oetzel［20］研究發現，奶牛發生SARA時瘤胃內乳酸濃度為0.45～0.74mmol／L；Keunen等［21］報道奶牛瘤胃液中乳酸含量小于10mmol／L；胡紅蓮等［22］認為，當日糧中非纖維性碳水化合物／中性洗滌纖維（NFC／NDF）達到2.58時，奶山羊瘤胃中才檢測到乳酸，但其含量低于0.1mmol／L。本研究發現，瘤胃內存在少量乳酸，其最高濃度低于1 mmol／L，此結果與以往的報道相一致［19，23］。正常情況下，當瘤胃pH下降到6左右時，乳酸生成菌迅速增加，而乳酸利用菌增長速度較慢。本研究發現，對照組山羊在采食后1h瘤胃液pH下降到6左右時，乳酸含量激增，此后隨時間延長乳酸逐漸被利用或吸收，出現乳酸濃度下降，之后恢復到采食前水平。SARA組山羊在飼喂后1 h瘤胃內乳酸沒有出現迅速升高，而是呈先降低后上升的過程，并且在采食后期極顯著高于對照組（P＜0.01）。這可能是由于瘤胃長期處于病理狀態，菌群組成發生改變，也可能與高精料以及精料組成有關。據報道，苜蓿是高果膠（5%～10%）飼料，且富含鈣、鉀等堿性元素，具有較強的緩沖能力，果膠雖在瘤胃中降解快，但發酵產物是半乳糖醛酸，抑制了酸性乳酸菌的發酵，從而有助于瘤胃液pH值的穩定［24］。在本研究中，SARA組飼料中玉米和麩皮含量高，為乳酸生成菌提供充足的碳源和能源，其中麩皮能增強乳酸菌的耐酸性［24，25］。因此，瘤胃內乳酸的積累促進了SARA酸中毒的發展，與以往的研究結果相一致［8］。眾所周知，飼料的組成和消化利用率影響反芻動物內分泌水平和生產性能［26，27］，SARA對反芻動物內分泌、乳成分和乳產量的影響及確切機制仍待進一步研究。

3.2 不同精粗比對脂多糖的影響

脂多糖也是引發SARA的誘因之一。在正常生理狀態下，反芻動物瘤胃和血液中含有少量LPS［28］，肝臟和網狀內皮系統完全可以清除這些毒素，所以不會引發內毒素血癥。而有資料報道，谷物誘導反芻動物發生SARA時往往伴隨著瘤胃和血液中LPS的升高［8，29，30］。SARA時瘤胃內酸度逐漸增加，革蘭氏陰性菌大量裂解，釋放內毒素——細胞壁主要成分LPS［4，5］，損傷侵染瘤胃壁并少量轉移至血液，導致內毒素血癥［7］。本試驗研究結果與以往報道相一致，SARA組山羊血液中LPS含量顯著高于正常組，日糧處理對瘤胃液和血漿內LPS均有顯著性影響，并且無論是采食前還是采食后，SARA組瘤胃液和血漿內都含有高濃度LPS，提示系統性炎癥反應的存在，而LPS的增加可能反過來又加劇了SARA的病情，提示LPS與SARA之間具有相輔相成的效應。

3.3 不同精粗比對體內皮質醇的影響

目前，有關SARA期間體內皮質醇濃度變化的研究較少，但注射LPS或IL－6均可引起皮質醇的升高。奶牛注射LPS后其外周血中皮質醇和腫瘤壞死因子濃度升高［10，11］，LPS可刺激單核細胞、巨噬細胞和內皮細胞引起血液皮質醇、促乳素和腫瘤壞死因子濃度的增加［31］，而免疫細胞所釋放的細胞因子導致應激軸HPA軸的激活［32］。Niel等［11］的研究證明，給綿羊注射IL－6可引起外周血促腎上腺皮質激素和皮質醇濃度的升高，并將這2項指標作為HPA軸激活的標志。本研究發現，SARA組在采食前血漿皮質醇濃度均高于對照組，提示SARA組山羊HPA軸被激活，機體可能處于一種慢性應激狀態。本研究還發現瘤胃液中也存在皮質醇，但濃度顯著低于血漿中濃度，關于瘤胃內皮質醇的來源，可能是經血流通過唾液和瘤胃壁進入瘤胃（內源性）［33］。有學者指出，反芻動物下丘腦－垂體－靶細胞分泌的激素可以作用于機體特殊的靶細胞——瘤胃微生物而影響瘤胃代謝，瘤胃內容物存在內分泌激素和遞質，如甾體類激素17β－雌二醇，可參與調節瘤胃內微生物的發酵［34，35］。此外，本試驗還發現SARA組山羊瘤胃液中皮質醇水平在采食后2～6h顯著高于對照組（P＜0.05），并且日糧類型對瘤胃液中皮質醇濃度具有極顯著影響（P＝0.006）。而有關高濃度皮質醇是否會對瘤胃發酵和瘤胃壁營養物質的吸收產生影響，或者是否與內毒素LPS一起促進瘤胃壁的損傷造成內毒素血癥，仍有待于進一步研究。

糖皮質激素作為主要的應激激素，參與調節機體免疫功能、炎癥反應和物質代謝等功能，慢性應激常導致機體物質代謝的紊亂［36，37］。肝臟作為體內重要的物質代謝器官，在糖、脂肪、蛋白質和維生素等物質代謝中起重要作用，肝臟上存在高豐度的糖皮質激素受體GR，接受糖皮質激素的信息并作出適應性調節［13］。本試驗中，SARA組山羊血液皮質醇濃度顯著升高，伴隨肝臟GR基因表達顯著下調，此現象是機體應對糖皮質激素升高的負反饋調節結果。肝臟糖皮質激素受體轉錄水平的下調是否引起下游信號通路的改變，以及對肝臟物質代謝及營養重分配是否產生影響仍需進一步研究。

4 結論

本研究在成功誘導泌乳期山羊瘤胃SARA的基礎上，分析了瘤胃液中pH、LPS和乳酸的變化，并首次報道SARA時血漿和瘤胃液中糖皮質激素水平升高以及肝臟GR受體的反饋性下調，提示患SARA時HPA軸的激活可能引起肝臟的物質代謝和營養物質重分配的改變。

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