CNTF基因的多態性與中國越野滑雪運動員運動能力的相關性分析

韓偉 ，李麗

（哈爾濱體育學院，黑龍江 哈爾濱 150008）

CNTF基因的多態性與中國越野滑雪運動員運動能力的相關性分析

韓偉 ，李麗

（哈爾濱體育學院，黑龍江 哈爾濱 150008）

探討中國越野滑雪運動員運動能力與CNTF基因多態性的關聯性，為越野滑雪運動員的基因選材提供前期探討性的理論依據與基礎數據。方法：采用PCR-RFLP方法測定30名越野滑雪運動員與30名普通大學生的基因的多態性。結果：對照組等位基因頻率為A=10.17%，G=88.13%，基因型頻率為A/A=0%，A/G=20.69%，G/G=79.31%，越野滑雪運動員等位基因頻率為A=20%，G=80%，基因型頻率為A/A=6.67%，A/G=26.67%，G/G=66.67%。經卡方檢驗不符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，且CNTF基因型分布和等位基因與對照組的基因型頻率和等位基因頻率無統計學意義（P＞0.05）結論：CNTF基因的多態性與中國黑龍江省越野滑運動員運動能力無相關性。

基因多態性 ; 運動能力 ; 選材

隨著科學技術的高速發展，分子生物學尤其是基因選材的研究日趨深入。近年來，此方面已成為選材的研究熱點，也取得了令人鼓舞的成果。研究表明機體的某些運動能力（力量、耐力、速度等）具有相當高的遺傳度。睫狀神經營養因子（Ciliary neurotrophic factor,CNTF）是體內具有多種生物學功能的細胞因子，能夠促進運動、感覺等神經元的存活，防止神經損傷對副交感神經有營養作用，對感覺神經元和交感神經也有一定的作用[1]。研究發現骨骼肌中存在著大量的CNTF的受體[2],它不僅對神經細胞起作用，而且對骨骼肌的生長及功能也起到營養作用[3]。CNTF基因的多態性與運動能力有較大的關系，GA基因型攜帶者的肌肉力量與爆發力顯著高于GG和AA基因型攜帶者[4]，提示CNTF基因的多態性與人體肌肉力量有關聯，但由于此方面研究較少，大多從綜述的角度加以總結，缺乏大量的實驗研究和結果，需深入系統地研究。優秀運動員選材是體育科研界一項重要的工作,不但可以幫助教練員盡早發現，挖掘具有特殊競技能力的人才，而且可節省大量的人力、物力和財力[5]。我國越野滑雪運動雖起步較晚，但已有向世界比賽牌沖擊的潛力。越野滑雪運動作為體能主導類項目, 運動員的力量和耐力素質對運動成績起著決定性作用[6]。研究力量相關基因CNTF的多態性與越野滑雪運動的關聯必將為此項目的選材提供實驗的數據。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗對象

實驗組：中國黑龍江越野滑雪隊隊員30名，運動等級一名國際健將，9名國家級健將、其余為國家一、二級運動員。訓練年限平均5.75年。年齡17～24歲。對照組：選擇哈爾濱體育學院運動人體科學專業的本科學生30名作為實驗對象，年齡在18～22 歲；未經任何專業訓練。測試人員全部為北方漢族，測試時身體健康。

1.2 實驗內容

采用PCR-RFLP方法對越野滑雪運動員和普通大學生CNTF基因多態性的頻率分布分析，CNTF基因A/G多態性的分布特征。

1.3 實驗儀器

PCR擴增儀（德國 eppend 22331)；北京水平板電泳儀（DYY1113）；上海復日紫外與可見光分析裝置、成像系統及其軟件（FR-200）。

1.4 CNTF基因A/G多態性測定過程

1.4.1 取靜脈血5ml，加入2%EDTA混合抗凝，由白細胞制備模板DNA，promega 公司全血總DNA 提取專用試劑盒提取。

1.4.2 引物的選擇、合成、擴增及質控根據Takahashi[9]等報道的堿基序列，參考Thome[7]等報道的引物序列由華大公司進行合成，常規處理保存。

引物序列：S 5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTTT CT -3’

AS 5’-CAG GTT GAT GTT CTT GTT CAT GCC C-3’

1.4.3 擴增體系：25μL 反應體系:10×Taq buffer 5μL dNTP 0.5μL，上下游引物各 2μL（10 pmol），Taq酶0.125Ul，模板DNA 2L,以滅菌雙蒸水補足體積。反應條件：預變性95℃ 5 min，變性94℃ 30s，退火60℃ 20s，延伸72℃ 10s，35個循環，終末延伸72℃ 7min。擴增產物以3 %瓊脂糖凝膠電泳40min。(以上試劑由promega公司提供)

1.4.4 酶切酶切體系:20μl,HaeⅢ限制性內切酶0.5μl，BSA0.2μl,擴增產物17.3μl, buffer 2ul。反應條件：37℃水浴,2.5h。(以上試劑由promega公司提供)

1.4.5 電泳酶切產物在含有0.5μg/ml EB的3 %的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker DL2,000為片段長度標志，電壓100 V，電泳30 min。凝膠成相儀監測結果并留取照片(見圖1)。

圖1 CNTF基因瓊脂糖凝膠電泳圖

1.5 數據處理

數據由SPSS11.5 for Windows 軟件包處理。等位基因和基因型頻率分布經基因平衡定律（Hardy-Weinberg, H-W）檢驗，以確認所選人群具有群體代表性。等位基因和基因型頻率采用基因計數法計算。組間等位基因和基因型頻率分布采用卡方檢驗。

2 實驗結果

2.1 CNTF基因的實驗結果

睫狀神經因了（CNTF）因它能促進雞胚睫狀神經節神經元存活而得名，具有200個氨基酸的殘基，基因定位11q12,由一個內含子和兩個外顯子組成，HaeⅢ多態位點位于內含子和第二個外顯子之間，擴增后的長度為134bp,酶切后含酶切位點的等位基因為94bp、40bp,定義為G，不含酶切位點為134bp定義為A，出現了三種基因型G/G、G/A、A/A。

Lane1為Marker(1002003004005006007008009001000bp);

lane2、3為雜合子G/A電泳帶；lane4、5、6為純合子AA電泳帶；

lane7、8、9為純合G/G電泳帶；Lane10、11為PCR產物。

Lane1為Marker(1002003004005006007008009001000bp);

lane2、3為雜合子G/A電泳帶；lane4、5、6為純合子AA電泳帶；

lane7、8、9為純合G/G電泳帶；Lane10、11為PCR產物。

2.2 CNTF基因A/G多態頻率分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗

運動員組和對照組人群的分布卡方值為0.833＜X2(1)=1.77,（見表1）則P＜0.05，不符合Hardy-Weinberg,H-W）遺傳平衡定分律，本研究所選擇的受試對象沒有群體代表性。

3 討論

3.1 實驗對象的選擇

選用遺傳學理論與方法進行研究時，各種因素對其結果的影響遠遠高于其它實驗。而實驗對象選擇的正確與否直接決定著結果的可信度和代表性。本研究在實驗對象的選材上盡量避免可預見性的因素干擾，以求研究結果具有一定的代表性。

3.1.1 樣本量的選擇 群體遺傳學是觀察人群中遺傳結構及其變化規律的，其變化主要表現在基因型頻率和等位基因頻率的狀態。其中，影響這種狀態的最主要的因素之一是群體的大小[8]。最理想的樣本量在400～500人以上[9]。當前國內外如大多數的研究樣本量集中于250人以下。遠未達到理想的樣本量。如席翼研究人數最多的是對照組216人實驗組100人。英國H.Montgomery實驗室是當前此研究領域中杰出的實驗室之一，他們所選擇的研究對象也不超過80人，最少時是33人，樣本量的選擇也偏小。本實驗選取了黑龍江省越野滑雪隊，由于我國冰雪運動起步較晚，使得我國的越野滑雪運動與世界一流水平存在著一定的差距。在政府和社會各方面力量的支持下，我省的越野滑雪項目有了長足的進步。但由于越野雪運動受地域、經濟、人們喜愛程度等諸多因素的影響，導致我省越野滑雪項目參加的人數少，有優異成績的專業運動員更少。本實驗所選擇的30名運動員,其中黑龍江省一隊的15名運動員中國際健將級運動員1名、國家健將級的9名、國家一級運動員2名、二級運動員3名，其它運動員全部為省級運動員達到了優秀運動員的標準。可以說此30名運動員代表了我國越野滑雪運動員的水平。對照組人數的選擇考慮在統計時人員的齊性相對應地選擇了北方漢族30名。CNTF的研究多集中于神經疾病和精神類疾病的治療方面，此基因的多態性與力量關聯的研究實驗還處于初步階段，可用于同一項群的橫向比較和不同人群的縱向比較的數據寥寥無幾。由于所選擇的人數具有局限性，可能會影響到統計學的結果。本研究對于黑龍江省越野運動員特定的范圍進行研究，旨在為我國冰雪運動員的科學選材提供數據。

3.1.2 運動項目的選擇 國內外在基因選材的研究中對運動項目的選擇多集中于長跑、登山、游泳等項目。對于冬季項目的基因選材的研究未見系統的報道。只有Rankeinen[10]選擇了包括越野滑雪、冬季兩項和中長跑等耐力運動員192名與189名健康者ACEI/D 基因型比較,結果也無差別。但此實驗的研究對象為高加索人，因為種族對基因選材的影響較大，本研究選取中國漢族越野滑雪運動員作為研究對象填補了基因選材的國際空白。

3.2 CNTF基因多態性與運動能力

CNTF是約200個氨基酸組成的多肽激素。由成熟個體外周神經中的施旺細胞、星形細胞中的一些亞細胞群體和中樞神經系統分泌的胞液分子[11-12]，而非由靶組織分泌[13]。CNTF最初被認為是睫狀神經節副交感神經元培養時的營養因子，并由此命名[14]。Komi等對31對兩性雙生子的股外側肌進行活檢研究，結果發現：I型肌纖維的分布比例是基因型依賴性的[15]。Simoneau的研究提示:無氧耐力和高強度周期性訓練引起相關最大酶活性變化由基因型決定[16]。Maes等對10歲的雙生子及他們的父母進行肌肉力量的研究得出：肌靜力、爆發力和功能性肌肉力量均表現為遺傳傳遞誘導或主要由遺傳控制[17]。王珮等研究表明：我國優秀女子力量運動員的CNTF基因多態性與普通人相比沒有顯著性差異[18]。本實驗結果顯示，越野滑雪運動員屬于特殊人群，無群體代表性，且基因型頻率與等位基因頻率無差異。對于所選擇的同一試驗對象，共測定兩種運動相關的基因多態性，分別是ACE基因的多態性和CNTF基因的多態性。但結果截然不同，ACE基因既有群體代表性且基因型頻率和等位基因頻率與對照都有差異。分析CNTF基因無群體代表性的可能性，其一是所選取的樣本人數少，但ACE也是同樣樣本卻有群體代表性，說明此可能不大。其二，CNTF與對照組就是無任何差異，無論從代表性還是基因型和等位基因，此結果與Rankeinen結論相一致。提示中國越野滑雪運動員力量素質與CNTF的多態性無關。

4 結論

中國越野滑雪運動員CNTF可能因為所選取的樣本數量有限而得出無代表性的結論。但也不排除此項目所選取的運動員CNTF基因多態性與力量素質無關的可能性。今后可繼續加大樣本量為我國開展冰雪運動員基因選材提供前期的準備和實驗數據。

［1］劉建香，馬紅雨.睫狀神經營養因子cDNA的克隆、表達、純化及生物活性測定［J］.求恩醫科大學學報，2001（6）：584-586.

［2］Sleeman MW,Anderson KD,Lamber PD,et al.The liliary neurotrophic factor and its receptor,CNTF alpha［J］ .Pham Acta Helv ,2000（74）：265-272.

［3］Bartlett SE,Bank GB,Reynold AJ,et al.Alterations in ciliary neurotophic factor singnaling in rapsyn deficient mice［J］.Neurosci Res,2001（64）:575-581.

［4］胡 揚.體育科研中的基因多態性戰略［J］.中國運動醫學雜志,2005(5):619-623.

［5］何子紅，胡揚.運動能力相關基因標記的研究策略及方法［J］.中國運動醫學雜志,2006(5):684-691.

［6］董 平，范 靜.對青少年越野滑雪運動員力量和耐力訓練的思考［J］.冰雪運動,2010(3):46-49.

［7］Thome J, Rosler M, Riederer P,et al. In reply-CNTF and psy-chiatric disorders(ltr)［J］.Nature Genet, 1996（13）: 144.

［8］李 璞.醫學遺傳學［M］.北京:中國協和醫科大學出版社，1999.

［9］朱玉賢,李 毅.現代分子生物學[M].北京:高等教育出版社，1997.

［10］RANKINEN T, WOLFARTH B, SIMONEAU JA, et al. No association between the angiotensin-converting enzyme ID polymorphism and elite endurance athlete status［J］. J Appl Physiol 2000（88）:1571- 1575.

［11］Friedman B.SchererSS, Rudge JS,etal.Regulation of cil-iary neurotrophic factor expression inmyelin-related Schwamn cell in vivo［J］. Neuron, 1992,（9）: 295-305.

［12］SendtnerM, Schmalbruch H, Stockli KA, et al.Ciliary neu-rotrophic factor prevents degeneration ofmotor neurons inmous mutant progressive motor neurotrophy［J］. Nature, 1992,（385）: 502-504.

［13］Spector SA, et al. Effects of elimination of activity on contrac-tile and histochemical properties of rat soleus muscle［J］. Neu-rosci, 1985（5）:2177-2188.

［14］Adler R, Landa K, Manthorpe M, et al. Cholinergic neu-rogrophic factors: introcular distriution of trophic activity for ciliary neurons［J］.Science,1979（204）: 1434-1436.

［15］Komi PV, et al. Skeletal muscle fibres and muscle enzyme ac-tivities in monozygous and dizygous twins of both sexes［J］.ActaPhysiol Scan,1977（100）:358-392.

［16］Simoneau JA, et al. Inheritance of human skeletal muscle and anaerobic capacity adaptation too high-intensity intermittent training Int［J］.Sports Med, 1986,7(3):167-171.

［17］Maes HH, et al. Inheritance of physical fitness in 10-yr-old twins and their parents［J］.Med Sci Sports Exe, 1996,28 (12):1497-1491.

［18］王珮，馬力宏.睫狀神經營養因子（CNTF）基因多態性與人體肌肉力量關聯的初步研究[C].2002年全國運動醫學學術會議論文摘要匯編，2002：270.

Analysis of the Correlation of CNTF Gene Polymorphism and Chinese Crosscountry Skiing Athletes Exercise Capacity

HAN Wei, LI Li
(Harbin Institute of Physical Education, Harbin 150008，Heilongjiang China)

Objective: investigate the correlation of Chinese cross-country skiing athletes athletic ability and CNTF gene polymorphism and then provide an initial exploratory theoretical basis and essential data for cross country skiing athletes gene Selection. Methods: use PCR-RFLP technology to assay 30 cross-country skiing athletes and 30 ordinary students gene polymorphism. Results show: Control group were A=10.17%，G=88.13%，The genotype frequencies in students were A/A=0%，A/G=20.69%，G/G=79.31%，. In cross-country skiing athletes, the allele frequencies were A=20%，G=80% The genotype frequencies in athletes were A/A=6.67%，A/G=26.67%，G/G=66.67%.They were not all in Hardy-Weinberg equilibrium there is not difference between cross-country skiing athletes CNTF gene A / G distribution and control group（ P＞0.05） Conclusion: There is not association between polymorphisms of CNTF gene and ability of exercise in cross-country skiing athletes in Heilongjiang province.

Plymorphism of CNTF gene; Eercise capacity; Sletion

G804.23

A

1008-2808(2012)04-0118-04

G804.23

A

1008-2808(2012)04-0118-04

2012-05-12；

2012-06-04

黑龍江省科技廳科技攻關項目（項目編號：2010G0491-00）。

韓偉（1961－），男，教授，研究方向為體育教育運動學。

編輯 郭霞