芪燈明目膠囊對VEGF轉基因斑馬魚血管生成的影響

陶錚 滕晉

近年來國內外對斑馬魚的研究逐漸深入,由于斑馬魚早期發育的過程中胚胎透明,可直接觀察到各組織器官,并且血管系統生成方式簡單,在顯微鏡下就能夠直觀的觀察到節間血管形態,因而以之作為理想的研究血管形成藥物篩選模式動物[1]。血管熒光標記的轉基因斑馬魚可以于熒光顯微鏡下清晰地進行斑馬魚節間血管的計數,考察藥物的抑制血管生成的作用,能夠快捷的計算抑制率。本試驗觀察芪燈明目膠囊對斑馬魚血管生成的影響,并且通過實驗得出斑馬魚的最大耐受濃度,對藥品毒理實驗提供參考指標。

1 材料與方法

1.1實驗材料

(1)VEGF轉基因斑馬魚由山東省科學院藥物篩選平臺提供,芪燈明目膠囊由成都中醫藥大學眼科實驗室提供。

(2)實驗儀器儀器:Airtech 潔凈工作臺,日本 OLMPUS SZX-16熒光顯微鏡,日本 OLMPUS X1倒置顯微鏡,培養皿,24孔板,滅菌手術器械(手術刀,剪刀,鑷子,注射器等),乙醚,酒精等。

1.2實驗方法

(1)斑馬魚準備:實驗所用的斑馬魚為血管熒光轉基因斑馬魚(VEGFR2:GFP)。斑馬魚的養殖和培育參照Westerfield[2]的方法。選擇成熟斑馬魚雌雄一對,傍晚時放入培育缸中,產卵后取出受精卵,單獨放入28℃光照培養箱備用。

(2)施藥:魚胚胎于24hpf后取出,置于1 μg·ml-1鏈霉蛋白酶溶液中數分鐘后,用吸管吹去胚胎卵膜,將脫膜胚胎加入24孔板中,每孔20只;將試驗藥物加入24孔板中,分別設置對照組,對照組10個,不加入任何藥物;芪燈膠囊組分別配制終濃度為165 μg·ml-1、248 μg·ml-1、330 μg·ml-1、495 μg·ml-1、660 μg·ml-1、825 μg·ml-1等6個組,24小時后觀察結果。

(3)結果觀察:將試驗用24孔板取出,每孔取出 30 μl溶液,加入 1‰三卡因溶液麻醉魚體,隨后用吸管吸出魚體放于載玻片上,在熒光顯微鏡下觀察記錄斑馬魚異常和血管熒光強弱狀況,并對體節間血管計數,同時記錄死亡數。

1.3血管抑制率的計算

多個樣本均數采用單因素方差分析,組間比較采用t檢驗。

2 實驗結果

2.1斑馬魚節間血管抑制率實驗

實驗結果顯示芪燈明目膠囊具有抑制血管生成的作用,在248 μg·ml-1至660 μg·ml-1抑制率表現出統計學差異,即使在濃度165 μg·ml-1時仍然具有部分抑制節間血管形成的作用,表現出芪燈明目膠囊能明顯抑制斑馬魚模型體節間血管生成。

表1 芪燈明目膠囊對斑馬魚胚胎體節間血管生成的抑制作用

注：與對照組相比較,*P<0.05,**P<010

圖

2.2斑馬魚最大耐受濃度實驗

結果顯示,用藥組胚胎165 μg·ml-1～495 μg·ml-1均能良好生長,660 μg·ml-1濃度以上各組胚胎出現了心率緩慢和翹尾的體態變化,濃度達到825 μg·ml-1大部分胚胎死亡,僅有少部分存活。

通過該實驗我們可以看到,芪燈明目膠囊對于斑馬魚最大耐受濃度達到660 μg·ml-1,通過其與大鼠劑量轉換關系,再結合《人和動物的體表面積計算法、不同種類動物之間藥物劑量換算法》[2]推論出芪燈明目膠囊人最大耐受劑量為105.6 mg/kg。

3 討論

斑馬魚是近年來新興的抗血管生成藥物篩選模型,具有易于觀察、實驗周期短、樣品用量少等優點,與分子、細胞水平篩選模型相比較有自身的優勢。國外學者研究認為斑馬魚胚胎特別是血管熒光轉基因斑馬魚胚胎是一種較理想的抗血管生成活性評價活體動物模型[3]。本試驗應用此模型研究了芪燈明目膠囊的抑制血管生成作用,結果顯示其能夠抑制斑馬魚胚胎體節間血管生成。本實驗中所用轉基因斑馬魚是將熒光蛋白標記在血管 VEGFR2上,血管在紫外光激發下顯現出熒光血管的形態,可在顯微鏡下直接觀察計數,觀察血管的形成非常簡易方便。

芪燈明目膠囊是針對糖尿病視網膜病變非增殖期的陰虛燥熱,肝腎虧虛和目絡癖滯的基本病機,以益氣養陰,活血通絡之法,結合臨床及中藥的現代研究的成果,優選三味中藥并對其進行了現代工藝的提取,確定以黃酮類物質為主的有效部位群制而成。DR的發生發展與VEGF、FGF、EGF等多種新生血管生長因子有關,VEGF是一種直接反映視網膜新生血管進程的重要的分子信號,在視網膜病變的早期發展中起重要的作用[4]。此次研究,過觀察藥物對轉基因熒光標記VEGFR2的斑馬魚血管生成的影響,證明了芪燈明目膠囊對VEGF2的抑制作用,能夠對糖尿病視網膜病變的發生發展起到一定的預防和治療作用,也為接下來的機制研究提供證據支持。

[1] Westerfield M,Wegner J,Jegalian BG,Specific activation of mammalian Hox promoters in mosaic transgenic zebrafish[J].Genes Dev,1992 Apr;6(4):591-8.

[2] 章元沛.藥理學實驗[M].2.人民衛生出版社:238.

[3] Cross LM,Cook M A,Lin S,et al.Rapid analys is of angio-genesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay [J].Arterio-scler Thromb Vasc Biol,2003,23(5):911-912.

[4] 李強,段俊國,王紅義.芪燈明目膠囊對自發性糖尿病大鼠視網膜蛋白激酶C表達的影響[J].眼科新進展,2010,3(3):210-213.