超聲波輔助-頂空固相微萃取-氣相色譜法測定葡萄酒中痕量2，4，6-三氯苯甲醚

張素娟 梁寶愛 孫麗萍 李建珍

（山西省食品質量安全監督檢驗研究院，太原 030012）

·食品分析·

超聲波輔助-頂空固相微萃取-氣相色譜法測定葡萄酒中痕量2，4，6-三氯苯甲醚

張素娟*梁寶愛 孫麗萍 李建珍

（山西省食品質量安全監督檢驗研究院，太原 030012）

建立了超聲波-頂空固相微萃取-氣相色譜檢測葡萄酒中的痕量木塞污染物——2，4，6-三氯苯甲醚（TCA） 的方法。試驗結果表明，該方法有良好的線性關系，相關系數為0.999 89，方法定量限為0.5 ng/L，相對標準偏差RSD在1.98%～5.32%之間，加標回收率為89.0%～103.2%。該方法操作簡便、快速、準確度高、重現性好，適用于普通實驗室對葡萄酒中痕量TCA殘留的檢測。

TCA；超聲波；頂空固相微萃取（HS-SPME）；葡萄酒

1982年，2，4，6-三氯苯甲醚（TCA） 被發現是污染葡萄酒品質的主要元兇之一。曲霉菌、青霉、木霉等真菌在潮濕環境下可將酒瓶軟木塞中的氯酚轉化為氯苯甲醚，軟木從加工到葡萄酒的裝瓶都可能會暴露此種環境下，導致TCA的形成。研究報告表明，由軟木塞遷移到葡萄酒中TCA的質量濃度約在2.4 ng/L～210.0 ng/L之間。據估計，2%～5%的瓶裝葡萄酒因瓶塞受到TCA污染。由于痕量的TCA感官閾值非常低，對葡萄酒的風味和品質造成不可逆的破壞，世界范圍內每年因TCA污染造成的經濟損失估計為100億美元。國外檢測TCA的方法較多，有頂空固相微萃取方法，微波萃取、索氏提取、壓力溶劑萃取、攪拌棒吸附萃取、固相萃取等方法，國內對TCA的檢測方法較少，僅有固相微萃取法。本文基于以上研究，首次采用超聲波輔助頂空固相微萃取-氣相色譜法測定葡萄酒中的痕量TCA，優化了萃取前處理條件，方法簡便、高效、靈敏度高。

1 材料與方法

1.1 儀器

氣相色譜儀，配ECD檢測器，日本島津GC-2010；固相微萃取裝置，supelco公司，配5種萃取頭；KQ5200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C型數字酸度計，雷磁儀器廠；BSA124S-cw分析天平，Sartorius；BSA2202S電子天平，Sartorius；40ml樣品瓶，supelco公司。

1.2 試劑

無水乙醇、氯化鈉、L（+）-酒石酸、氫氧化鈉，優級純；甲醇，色譜純；實驗室用水，超純水；2，4，6-三氯苯甲醚，純度（質量分數） ≥99%。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標準儲備液的配制

精確稱取三氯苯甲醚10 mg溶于10 mL甲醇溶液中，配制成質量濃度為1 mg/L的標準儲備溶液，然后用甲醇溶液稀釋至1 μg/L和10 μg/L，搖勻置于4℃冰箱儲存備用。

1.3.2 標準工作液的配制

用1 mol/L氫氧化鈉溶液將體積濃度12%乙醇溶液（含有3.5 g/L 的L（+） -酒石酸） 調pH值為3.5，作為配制標準工作液的溶劑，分別配制濃度為0ng/L、1ng/L、5ng/L、10ng/L、25ng/L、50 ng/L、100 ng/L的TCA標準工作溶液。

1.4 色譜條件

毛細管柱：DB-17（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；載氣：氮氣；流速：1.0 mL/min；進樣方式：無分流；進樣時間：2 min；進樣口溫度：270℃；檢測器溫度：300℃。

升溫：初始溫度40℃，保持2 min；13℃/min升溫至150℃，保持8 min，25℃/min升溫至250℃，保持11 min。

1.5 分析步驟

準確移取稀釋酒樣（1倍體積） 25 mL，置于40 mL頂空進樣瓶中，加入濃度3 mol/L的NaCl溶液4.4 g，用硅膠隔墊密封，置于超聲波清洗器中，在 40℃下，預超聲 10 min，再用 50 μm/30 μm DVB-CAR-PDMS萃取頭萃取超聲40 min后，拔出，在GC進樣口熱脫附2 min，樣品經色譜系統分離后，用ECD檢測器進行檢測，由保留時間定性，外標法峰面積定量。

2 結果與討論

2.1 萃取方式的選擇

在其他條件相同的情況下，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對磁力攪拌和超聲波兩種輔助萃取方式進行比較，結果如圖1。

圖1 不同萃取方式對萃取效率的影響

由圖1可以看出，超聲波比磁力攪拌的萃取率提高了32%，可見超聲波的空化效應促進了TCA脫溶劑，且易從溶液中溢出，表明超聲波輔助可大大提高方法的靈敏度。

2.2 H S-SPM E萃取條件的優化

對于頂空固相微萃取來說，目標化合物的吸附量主要取決于萃取頭涂層、液體表面上的壓力、頂空體積以及溶質擴散的性質。所以分別就萃取頭的選擇、超聲功率、吸附時間、鹽（NaCl）的用量、溫度等條件進行了優化研究。

2.2.1 萃取頭的選取

分別用 100 μmPDMS、65 μmPDMS/DVB 和 75 μmCAR/PDMS、85 μmPA、50/30 μm DVB/CAR/PDMS5種涂層在相同條件下進行頂空萃取，其結果見下頁圖2、圖3。

從圖2、圖3中可以看出，在不同時間內65 μm PDMS/DVB和 50/30 μmDVB/CAR/PDMS涂層的萃取效果明顯較高，且對超聲敏感。其中50/30 μm DVB/CAR/PDMS的萃取靈敏度最高，因此確定采用該涂層萃取頭。

圖2 不同萃取頭對萃取效率的影響

圖3 不同萃取頭萃取效率的變化

2.2.2 樣品體積的確定

因為頂空固相微萃取與樣品瓶中的頂空體積有密切關系。一般認為在萃取溫度不變的情況下，頂空體積越小，萃取效率越高。在40 mL樣品瓶中加入不同體積的相同濃度的標準工作溶液，在一定試驗條件下，考察了樣品體積對萃取效率的影響（見圖 4）。

圖4 溶液體積對萃取效率的影響

從圖4中明顯看出，隨著樣品體積的增大，頂空體積的減小對三氯苯甲醚萃取效率越來越高。但考慮空容體積太小會使萃取頭浸入液體中，因此選擇取樣體積為25 mL。

2.2.3 超聲功率的選擇

超聲功率的大小決定了傳質速度的快慢，對溶液中溶質的擴散與飽和蒸氣壓有一定的影響，在其他條件相同的情況下，采用40%、60%、80%、100%超聲功率對峰面積和重復性進行了試驗。結果見表1。

表1 不同功率對萃取效率的影響

從表1可以看出，隨著超聲功率的增加，峰面積有所上升，但是在100%功率時重復性有所下降，因此選擇80%的超聲功率。

2.2.4 加入無機鹽的影響

離子強度不僅影響吸附熱力學，而且對吸附動力學也能產生一定的影響。所以通過加入不同量的 NaCl（0 mol/L，1 mol/L，2 mol/L，3 mol/L，4 mol/L，5 mol/L，6 mol/L） 改變溶液的離子強度，考察其對TCA萃取效率的影響（見圖5）。結果表明，隨著鹽加入量的逐漸增加，響應面積先增大后變化不明顯。但隨著鹽量的逐漸增加，色譜圖中雜峰明顯增大，所以選擇氯化鈉的濃度為3 mol/L。

圖5 鹽加入量對萃取效率的影響

2.2.5 萃取時間的選擇

選擇 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和80 min不同萃取時間進行試驗，結果表明，對TCA的響應隨著萃取時間延長而增加，當萃取時間為40 min時，處于拐點，隨著時間的增加萃取效率處于緩慢增加的狀態。故選擇萃取時間為40 min。

圖6 萃取時間對萃取效率的影響

2.2.6 萃取溫度的選擇

在一定溫度下溶液體系達到氣液平衡時，氣相的組成與樣品原來的組成成正比關系。體系溫度升高到一定程度，氣相中各組分濃度變大，有利于纖維的吸附，試驗考察了30℃、40℃、50℃、60℃4個溫度點，采用超聲輔助HS-SPME-GC-ECD法進行檢測分析，吸附效率隨溫度升高略有提高（見圖7），但過高的溫度操作不方便且增加其他雜質的釋放。因此選擇萃取溫度為40℃。

圖7 萃取溫度對萃取頭吸附效率的影響

2.3 分離條件的優化

2.3.1 解析時間的選擇

解析時間的選擇對目標分析物的定量分析也是關鍵因素之一，太短的解析時間不能使目標化合物充分釋放，致使解析率降低。太長的解析時間將導致纖維涂層高溫環境緩慢降解。本試驗選擇了1 min、2 min、5 min進行試驗，發現解析2 min后目標化合物已全部釋放出來。

2.3.2 色譜條件的選擇

根據TCA的結構性質，選擇了ECD檢測器和中等極性毛細管柱柱（DB-17），通過標準工作溶液和添加葡萄酒中進行與干擾峰的分離，最后選定了1.4中的最佳色譜條件。加入葡萄酒中的標準溶液譜圖見圖8。

圖8 加入葡萄酒中TCA色譜圖

2.4 方法的線性范圍、檢出限、精密度和回收率

在優化條件下，用6次測定結果的平均值繪制標準曲線，見圖9。回歸方程為y=61 616.2x+123 657.1，TCA含量在1.0 ng/L～100 ng/L范圍內呈線性關系，標準曲線的線性相關系數R2=0.999 893 7。按3倍的信噪比方法計算檢出限為0.2 ng/L，定量限為0.5 ng/L。

圖9 TCA的標準曲線濃度/ng·L-1

選取6種不同的葡萄酒樣品進行測定，同時加不同濃度的標準溶液，測得加標回收率在89.0%～103.2%之間，相對標準偏差（RSD） 介于1.98%～5.32%。見表2。

表2 方法的精密度和回收率（n=6）

3 結論

采用超聲波輔助HS-SPME萃取葡萄酒中的TCA，可大大提高檢測的靈敏度，方法檢出限為0.2 ng/L，方法定量限為0.5 ng/L，線性范圍1.0 ng/L～100 ng/L，RSD在1.98%～5.32%之間，加標回收率為89.0%～103.2%。該方法操作簡便、快捷、準確，適用于普通實驗室對葡萄酒中痕量TCA殘留的檢測。

［1］C.PEREIRA，L.GIL，L.CARRICO.Reduction of the 2，4，6-trichloroanisole content in cork stoppers using gamma radiation［J］.Radiation Physics and Chemistry，2007（76）：729-732.

［2］WHITFIELD FB，HILL JL，Shaw KJ.2，4，6-Tribromanisole a potential cause of mustiness in packaged food［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry ，1997（45）：889-893.

［3］HERESZTYN T.Metabolism of volatile phenolic compounds from hydroxyc in namic acids by Brettan am yces yeast［J］.Arch M icrobiol，1986，146：96-98.

［4］CHATONNET P，DUBOURDIE D，BOIDRON J，et al.The origin of ethylphenols in wines［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1992，60（2）：165-178.

［5］EVANS TJ，BUTZKE CE，EBELER SE.Analysis of 2，4，6-trichloroanisole in wines using solid-phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，1997，786：293-298.

［6］C.PIZARRO，N.PEREZ-DEL-NOTARIO，J.M.GONZALEZ-SAIZ.Optimisation of a headspace solid-phase microextraction with on fiber derivatisation method for the direct determination of haloanisoles and halophenols in wine［J］.Journal of Chromatography A，2007，1 143：26-35.

［7］C.PIZARRO，N.PEREZ-DEL-NOTARIO，J.M.GONZALEZ-SAIZ.Optimisation of maicrowave-assisted extraction method for the simulataneous determination of haloanisoles and halophenols in cork stoppers［J］.Journal of Chromatography A，2007，1 149：138-144.

［8］R.Juanola，D.Subira，V.Salvado，et al.Evaluation of an extraction method in the determination of the 2，4，6-trichloroanisole content of tainted cork［J］.Journal of Chromatography A，2002，953：207-214.

［9］OSCAR EZQUERRO，ALVARO GARRIDO-LOPEZ，MARIA TERESA TENA.Determination of 2，4，6-trichloroanisole and guaiacol in cork stoppers by pressurized fluid extraction and gas chromatography mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2006，1 102：18-24.

［10］A.ZALZCAIN，G.L.ALONSO，C.LORENZO，et al.Stir bar sorptive extraction for the anaysis of wine cork taint［J］.Journal of Chromatography A，2004，1 033：173-178.

［11］ALMUDENA MARTINEZ-UTUNUELA ，ISAAC RODRIGUEZ，RAFAEL CELA ，et al.Development of a solidphase extraction method for the simultaneous determination of chloroanisoles and chlorophenols in red wine using gas chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta ，2005，549：117-123.

［12］衛曉紅，李燕，張燕，等.固相微萃取-氣相色譜法測定葡萄酒及軟木塞中 2，4，6-三氯苯甲醚（TCA）［J］.釀酒科技，2010（4）：92-93；95.

［13］鄧曉軍，郭德華，李波，等.葡萄酒中痕量木塞污染物的頂空固相微萃取-氣相色譜串聯質譜法檢測［J］.分析測試學報，2008，27（12）：1 375-1 378.

［14］吳志堅，劉海寧，張慧芳.離子強度對吸附影響機理的研究進展［J］.環境化學，2010，29（6）：997-1 003.

Determination of trace 2,4,6-trichloroanisole(TCA)in wine by gas chromatography with ultrasonic oscillation assisted headspace solid phase micro-extraction（HS-SPME）

ZGABG Su-juan*LIANG Bao-aiSUN Li-ping LI Jian-zhen
（Shanxi province food quality safety supervision and inspection institute，Taiyuan 030012，China）

A new method used for the determination of trace contaminants of cork stoppers-2，4，6-trichloroanisole（TCA）in wine by Ultrasonic Oscillation assisted HS-SPME-GC，through the comparative study of pretreatment,extraction conditions and chromatographic separation condition optimization.The result shows that the method had taken on good linear relation with a correlation coefficient 0.999 89，the quantitative limit of the method was 0.5 ng/L，the repeatability（RSD）was from 1.98%to 5.32%,the recoveries were in the range of 89.0～103.2%.The method is simple，speediness，high accuracy，good reproducibility and suitable for general laboratory to detect trace TCA residues in wine.

TCA；ultrasonic wave； headspace solid phase microextraction（HS-SPME）；wine

TS262.6

A

1673-6004（2012）01-0044-05

*張素娟，女，1975年出生，2003年畢業于吉林大學分析化學專業，高級工程師

2012-03-03