亞低溫對大鼠全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的干預(yù)研究

陳輝，畢長柏，薛春琴，景曉平，陳建萍

亞低溫對大鼠全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的干預(yù)研究

陳輝，畢長柏，薛春琴，景曉平，陳建萍

目的探討亞低溫對大鼠全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡的影響。方法選取成年雄性健康清潔級Wistar大鼠42只，隨機分為假手術(shù)組、對照組及亞低溫組。亞低溫組和對照組采用大鼠4條血管阻斷全腦缺血模型(Pulsinelli－4VO法)制備大鼠全腦缺血再灌注模型，假手術(shù)組僅切開頸部皮膚和肌層暴露雙側(cè)椎動脈和頸動脈，不行椎動脈凝閉和頸總動脈夾閉。假手術(shù)組和對照組置于室溫下，亞低溫組給予亞低溫處理。采用流式細(xì)胞儀對海馬神經(jīng)元Bcl－2、Bax表達進行測定。結(jié)果假手術(shù)組、對照組及亞低溫組神經(jīng)元凋亡百分率及增殖指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=142.869，P＜0.01;F=153.993，P＜0.01)。假手術(shù)組Bcl－2、Bax表達(均道值)微弱，在此忽略;對照組Bcl－2、Bax表達(均道值)與亞低溫組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為63.747、28.803，P＜0.01);兩組Bcl/Bax比值比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.601，P＜0.01)。結(jié)論全身亞低溫可有效干預(yù)大鼠全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元凋亡，其機制與Bcl－2、Bax的表達有關(guān)，受到二者比值的調(diào)控。

再灌注損傷;亞低溫;細(xì)胞凋亡;Bal－2;Bax

隨著急救技術(shù)的提高，一些心肺復(fù)蘇、顱腦創(chuàng)傷、卒中、休克、窒息等危重患者存活率逐漸提高，這些疾病所造成的腦缺血損傷以及缺血再灌注損傷已成為研究熱點。從形態(tài)學(xué)、生化等多角度證實神經(jīng)元凋亡存在于腦缺血再灌注損傷中［1］。探討如何有效抑制凋亡是減輕腦缺血再灌注損傷的一個重要環(huán)節(jié)。亞低溫作為保護缺血性腦組織損傷的方法之一成為研究熱點。本研究通過觀察亞低溫作用對腦缺血后及腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡及Bcl－2、Bax表達的影響，旨在為臨床應(yīng)用提供可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組成年健康清潔級Wistar大鼠42只，雄性，體質(zhì)量250～280 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(合格證編號604186)。采用隨機區(qū)組設(shè)計方案分為3組，即假手術(shù)組(14只)、對照組(14只)和亞低溫組(14只)。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備亞低溫組和對照組采用大鼠4條血管阻斷全腦缺血模型(Pulsinelli－4VO法)制備大鼠全腦缺血再灌注模型。假手術(shù)組僅切開頸部皮膚和肌層暴露雙側(cè)椎動脈和頸動脈，不行椎動脈凝閉和頸總動脈夾閉。假手術(shù)組和對照組置于室溫下，術(shù)中及術(shù)后用60 W白熾燈照明，調(diào)節(jié)燈泡至大鼠的距離，以保持大鼠肛溫在(37.0±0.5)℃。亞低溫組于缺血再灌注后即刻給予亞低溫處理。在缺血時大鼠沒有出現(xiàn)昏迷或者發(fā)生了振顫、翻轉(zhuǎn)，以及在復(fù)灌時發(fā)生痙攣、癲癇等情況均被淘汰。

1.2.2 亞低溫的方法控制室溫在25～30℃，采用冰袋法誘導(dǎo)亞低溫。用冰袋覆蓋大鼠體表暴露部位，冰量按比例100 g/100 mg體質(zhì)量計算，誘導(dǎo)時間在10 min以內(nèi)。用歐姆龍(中國)有限公司生產(chǎn)的MC－108型電子體溫表(精度±0.05℃)，將探頭插入直腸4～5 cm測量直腸溫度，維持大鼠肛溫在(31.0±1.0)℃，每10 min測量大鼠肛溫1次，采用調(diào)整冰袋數(shù)量調(diào)節(jié)體溫，并嚴(yán)密觀察大鼠生命體征，維持6 h后，用白熾燈緩慢復(fù)溫至(37.0±0.5)℃，觀察1 h后放至籠中飼養(yǎng)。術(shù)后呼吸不平穩(wěn)，體溫不能維持(37.0±0.5)℃的大鼠被淘汰。

1.2.3 標(biāo)本的制備于再灌注及假手術(shù)后48 h麻醉動物(10%水合氯醛腹腔注射，350 mg/kg)，斷頭取腦，分離海馬組織置于70%乙醇中4℃保存待檢。

1.2.4 流式細(xì)胞分析儀檢測應(yīng)用流式細(xì)胞分析儀對海馬神經(jīng)元Bcl－2、Bax表達進行測定。鼠抗人Bax單克隆抗體及抗人Bcl－2單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics－XLⅡ型流式細(xì)胞儀，激發(fā)光源為15 mW氬離子激光器，激發(fā)波長為488 nm，應(yīng)用Expo 32 ADC進行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，用Muticycle AV分析軟件對DNA細(xì)胞周期擬和分析。

1.2.5 細(xì)胞增殖計算方法應(yīng)用DNA細(xì)胞周期分析軟件，計算出DNA組方圖各時相分布的百分比，以增殖指數(shù)(PI)表示細(xì)胞的增殖活性，公式:

注:S、G0、G1、G2、M分別表示細(xì)胞周期的不同時期，G0期表示靜止期;G1表示RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持2倍體;S期表示DNA從2倍體復(fù)制到4倍體;G2期表示DNA成為4倍體，繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì);M期表示將復(fù)制了的染色體分到兩個子細(xì)胞中。

1.2.6 蛋白表達定量分析以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白的相對含量，即:

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 組神經(jīng)元凋亡百分率比較假手術(shù)組神經(jīng)元凋亡百分率為(2.3±0.4)%;對照組為(15.1±2.0)%;亞低溫組為(3.5±0.2)%。3組神經(jīng)元凋亡百分率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=142.869，P＜0.01);其中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.23 組PI比較假手術(shù)組PI為(49.3±2.4)%;對照組為(8.8±1.2)%;亞低溫組為(37.6±2.9)%。3組PI比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=153.993，P＜0.01);其中兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.33 組Bcl－2、Bax表達均道值比較對照組及亞低溫組的FI均＞1.0，為陽性表達。

2.3.1 Bcl－2表達均道值比較假手術(shù)組Bcl－2表達(均道值)微弱，在此忽略;對照組為(293.5±19.1);亞低溫組為(364.2±15.1)。對照組Bcl－2表達(均道值)與亞低溫組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=63.747，P＜0.01)。

2.3.2 Bax表達均道值比較假手術(shù)組Bax表達(均道值)微弱，在此忽略;對照組為(402.0±8.2);亞低溫組為(201.7±13.5)。對照組Bax表達(均道值)與亞低溫組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=28.803，P＜0.01)。

2.3.3 Bcl－2表達均道值/Bax表達均道值(Bcl/Bax)比較

對照組Bcl/Bax比值為(0.73±0.49);亞低溫組為(1.81±0.15)。兩組Bcl/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.601，P＜0.01)。

3 討論

全腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞死亡有兩種方式，即壞死和凋亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的本質(zhì)區(qū)別在于前者是一種主動的死亡過程，并伴隨基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，特征性的變化是DNA的寡核小體間裂解，在凝膠電泳時呈現(xiàn)特征性的“DNA”梯［2］。細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為核固縮、胞膜發(fā)泡和凋亡小體形成。細(xì)胞凋亡是由特定的基因調(diào)控，無明顯細(xì)胞溶解的過程。腦缺血后神經(jīng)元壞死多發(fā)生在缺血后即刻及數(shù)分鐘至1 d內(nèi)出現(xiàn)損傷灶的中心部位。腦缺血所致的神經(jīng)元凋亡則主要出現(xiàn)在損傷灶四周的缺血缺氧區(qū)及半影區(qū)內(nèi)遲發(fā)型神經(jīng)元死亡和對缺血缺氧敏感的海馬、齒狀回和大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元。

近年來的研究表明，缺血再灌注損傷機制主要與氧自由基生成增多、細(xì)胞內(nèi)酸中毒、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)和基因調(diào)控等密切相關(guān)［3］。一定程度的低壓、低溫、低pH、低鈉、低鈣溶液灌流，可減輕組織器官的再灌注損傷，使其功能得以恢復(fù)，反之可誘發(fā)或加重再灌注損傷［4］。

Tang等［5］提出亞低溫可降低神經(jīng)元凋亡數(shù)量，降低促凋亡基因如Bax以及一些半胱氨酸蛋白酶的表達，同時增加抗凋亡基因Bcl－2等的表達。亞低溫也可能上調(diào)細(xì)胞生存途徑，如激活通路和增加營養(yǎng)因子的表達。Sahuquillo等［6］、Zhao等［7］及Hu等［8］亦有相同報道。Okazaki等［9］新近研究在大鼠線栓法致局灶性腦缺血再灌注后3 h輸入大鼠自體骨髓細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)在大鼠腦缺血3 d時大腦皮質(zhì)區(qū)Bcl－2表達明顯增加，同時測得該區(qū)脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP－生物素切口末端標(biāo)記(TUNEL)陽性凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，并且可見由腦缺血所致的行為異常有所改善。自體骨髓細(xì)胞輸入對腦缺血大鼠諸多方面的治療作用可能源自Bcl－2的抗腦缺血作用，并且Bcl－2的這種作用與抗缺血神經(jīng)元的凋亡作用有很大關(guān)聯(lián)。陶曉峰等［10］在大鼠局部腦缺血后30 min給予亞低溫4 h，分別于再灌注的不同時間點檢測Bcl－2的表達情況，得出結(jié)論，亞低溫能增加Bcl－2的表達，明顯減輕缺血所致的損傷，并能明顯抑制細(xì)胞凋亡，對大鼠缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)有確切療效。管玉華等［11］提出亞低溫對抗腦缺血后神經(jīng)元凋亡有5個信號傳導(dǎo)途徑，分別為Bcl－2家族調(diào)控、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶－3(caspase－3)途徑、促絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途徑、核因子κB(NF－κB)途徑、PI3K/Akt途徑。但是Sakurazawa等［12］在抗凋亡因子FNK與HLV/Tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合域融合的復(fù)合蛋白(PTD－FNK)和亞低溫聯(lián)合治療的研究中得出結(jié)論對神經(jīng)元凋亡的抑制途徑可能通過caspase－12，而并非Bcl－2途徑。本研究通過對亞低溫干預(yù)的全腦缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)元凋亡情況的研究，來探討B(tài)cl－2途徑是否和亞低溫的腦保護機制有關(guān)。

本研究對照組神經(jīng)元凋亡百分率明顯高于假手術(shù)組，PI明顯低于假手術(shù)組，表明全腦缺血再灌注損傷時海馬神經(jīng)元凋亡明確存在。對照組與假手術(shù)組比較，Bcl－2和Bax明顯表達，F(xiàn)I＞1.0，表達陽性，Bcl/Bax＜1.0，表明凋亡發(fā)生受到Bcl－2基因家族比例的調(diào)控，再灌注48 h以Bax表達占優(yōu)勢。亞低溫組和對照組的比較顯示亞低溫干預(yù)可顯著降低神經(jīng)元凋亡百分率，提高PI和Bcl－2表達，降低Bax表達。進一步比較亞低溫組和對照組的Bcl/Bax比值，亞低溫組比值大于對照組。

綜上所述，全身亞低溫可有效干預(yù)大鼠全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的凋亡，其機制與Bcl－2、Bax表達有關(guān)，受到二者比值的調(diào)控。亞低溫可以提高Bcl－2表達，降低Bax表達，從而使二者比值提高，干預(yù)神經(jīng)元的凋亡。所以Bcl－2家族與亞低溫對全腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元的保護機制有關(guān)，但是否多個途徑共同作用及之間的關(guān)系尚有待進一步研究。

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4 戴建明，譚美娟，黃波.亞低溫治療對中度腦外傷患者炎癥細(xì)胞因子的影響［J］.實用心腦肺血管病雜志，2009，17(4):250.

5 Tang XN，Yenari MA.Hypothermia as a cytoprotective strategy in ischemic tissue injury［J］．Ageing Res Rev，2010，9(1):61－68.

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7 Zhao H，Wang JQ，Shimohata T，et al.Conditions of protection by hypothermia and effects on apoptotic pathways in a rat model of permanent middle cerebral artery occlusion［J］．J Neurosurg，2007，107(3):636－641.

8 Hu WW，Du Y，Li C，et al.Neuroprotection of hypothermia against neuronal death in rat hippocampus through inhibiting the increased assembly of GluR6－PSD95－MLK3 signaling module induced by cerebral ischemia/reperfusion［J］．Hippocampus，2008，18(4):386－397.

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10 陶曉峰，劉暢，華正宇.亞低溫對大鼠局灶性腦缺血再灌注后HIF－1α及凋亡相關(guān)蛋白變化的影響［J］．中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2010，27(10):902－905.

11 管玉華，趙東剛.亞低溫抗腦缺血后神經(jīng)元凋亡的信號傳導(dǎo)途徑［J］．廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(13):1759－1761.

12 Sakurazawa M，Katsura K，Saito M，et al.Mild hypothermia enhanced the protective effect of protein therapy with transductive antideath FNK protein using a rat focal transient cerebral ischemia model［J］．Brain Res，2012，1430:86－92.

Intervention of Mild Hypothermia on Nervous Apoptosis after Global Cerebral Ischemic Reperfusion Injury in Rats

CHEN Hui，BI Chang－bai，XUE Chun－qin，et al.Department of Pediatric，Dahua Hospital of Xuhui District，Shanghai 200237，China

ObjectiveTo investigate the intervention effect of mild hypothermia on neuronal apoptosis after global cerebral ischemic reperfusion injury in rats.Methods42 Wistar male rats were divided into sham operation group，control group and mild hypothermia group.Global cerebral ischemic reperfusion model was established in mild hypothermia group and control group by Pulsinelli－4VO method.While the sham operation group was only given neck skin and muscular layer incision to expose bilateral vertebral artery and carotid artery，but occlusion of vertebral artery and carotid artery was not performed.The sham operation group and control group were in room temperature and the mild hypothermia group was in mild hypothermia environment.Flow cytometry was used to detect the expression of Bcl－2 and Bax in hippocampus.ResultsThe nerve cell apoptosis percentage and proliferation index between sham operation group，control group and mild hypothermia group showed statistically significant difference(F=142.869，P＜0.01;F=153.993，P＜0.01).The expression of Bcl－2 and Bax in sham operationgroup was ignored due to its weakness.The expression of Bcl－2 and Bax between control group and mild hypothermia group showed statistically significant difference(t=63.747 and 28.803，P＜0.01).The Bcl/Bax between the two groups also showed statistically significant difference(t=9.601，P＜0.01).ConclusionWhole body mild hypothermia can effectively decrease nerve cells apoptosis after global cerebral ischemic reperfusion injury and its mechanism is related to the expression of Bcl－2 and Bax and is regulated by the value of Bcl/Bax.

Reperfusion injury;Mild hypothermia;Apoptosis;Bcl－2;Bax

R 743

A

1007－9572(2012)11－3858－03

10.3969/j.issn.1007－9572.2012.11.096

200237上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院兒科(陳輝，薛春琴，景曉平，陳建萍);河北省人民醫(yī)院兒科(畢長柏)

陳建萍，200237上海市徐匯區(qū)大華醫(yī)院兒科;E－mail:chenhuidoctor@sina.com

2012－05－22;

2012－10－19)

(本文編輯:張小龍)