丹參對大鼠肢體缺血再灌注后多器官水腫的預防作用

趙利軍 孔小燕 門秀麗 李宏杰 吳 靜 劉麗華 張連元

丹參對大鼠肢體缺血再灌注后多器官水腫的預防作用

趙利軍 孔小燕 門秀麗 李宏杰 吳 靜 劉麗華 張連元

目的：探討丹參對大鼠肢體缺血再灌注（LIR）后多器官水腫的預防作用。方法：Wistar大鼠24只隨機分為對照組（C組）、缺血再灌注組（I/R組）和丹參預處理組（SM組）。用橡皮帶結扎動物雙后肢根部4 h，然后松解橡皮帶恢復血流灌注4 h制作大鼠肢體缺血再灌注模型，SM組在再灌注前30 min經(jīng)尾靜脈注射丹參注射液5 mL/kg。手術取血處死動物，準確留取每只動物的心、肝、腎、肺、腦、腸及骨骼肌組織各1 g。恒溫烘干后稱其干重并計算各標本的濕干重比值（W/D）。采用生物化學方法測定血漿超氧化物歧化酶（SOD）、黃嘌呤氧化酶（XOD）活性及丙二醛（MDA）水平。光鏡下觀察各組織的形態(tài)學變化。結果：LIR后各組織W/D均增加（P<0.05），血漿SOD活性降低，而XOD活性和MDA水平增加（P<0.05），鏡下可見各組織出現(xiàn)結構紊亂、組織間隙增寬和炎細胞浸潤等病理改變。而SM組與I/R組比較，血漿SOD活性回升，而XOD活性和MDA水平降低（P<0.05），鏡下組織病理學變化有所減輕。結論：LIR可導致多器官水腫，氧化應激是其重要機制之一。丹參可通過抗氧化發(fā)揮抗組織水腫的作用。

丹參 再灌注損傷 四肢 水腫 超氧化物歧化酶 黃嘌呤氧化酶 丙二醛 大鼠,Wistar

肢體缺血再灌注（limb ischemia reperfusion，LIR）損傷是臨床外科常見的病理現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)，肢體并非此過程中的唯一受損部位，機體其他遠隔器官也會受到累及[1-2]。氧化應激（oxidative stress）是缺血再灌注后體內氧化和抗氧化兩大拮抗體系失平衡的一種狀態(tài)，微血管內外組織液的動態(tài)交換可明顯受此影響而發(fā)生紊亂，組織細胞的功能、代謝甚至形態(tài)結構可出現(xiàn)損傷性變化。丹參（Salviamiltiorrhiza）是目前頗受關注的一種天然抗氧化物質，在LIR器官保護領域有重要的研究價值和應用前景。本研究制作大鼠LIR損傷動物模型，通過在同一時間點橫向觀察骨骼肌、心、肝、腎、肺、腦、腸等多個器官的變化，探討丹參對LIR后原位及遠位器官水腫的預防作用及其可能機制，為臨床再灌注損傷的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康清潔級雄性Wistar大鼠24只，體質量200~250 g，購自河南醫(yī)科大學動物中心。隨機分為3組（每組8只）：正常對照組（C組），缺血再灌注組（I/R組），丹參預處理組(SM組)。動物術前24 h禁食，飲水自由。

1.2 模型制備及標本采集 I/R組以我室常規(guī)應用的止血帶法復制大鼠LIR動物模型[1]，用標準化彈性的橡皮帶環(huán)繞結扎大鼠雙后肢根部阻斷血流4 h，然后松解橡皮帶恢復血流灌注4 h。C組動物松弛結扎雙后肢不阻斷血流，SM組在恢復血流再灌注前30 min經(jīng)尾靜脈推注丹參注射液（5 mL/kg）,其余2組在對應實驗時間點注射等劑量生理鹽水。實驗結束時自腹主動脈取血，4℃、3 500 r/min低溫離心15 min取血清留待生化測定。處死動物后留取心、肝、腎、肺、腦、腸及骨骼肌組織標本，濾紙吸干表面血跡后準確稱取各組織1 g置于載玻片上,標記后置于烤箱。留取骨骼肌組織病理學標本，常規(guī)固定、包埋、切片、HE染色后觀察組織病理學變化。

1.3 指標測定及試劑來源 丹參注射液（1 mL，含生藥丹參1 g）購自四川升和制藥廠（批號000036）。標本稱質量使用FA-2004型電子天平（上海天平儀器廠）。生化試劑盒購自南京建成生物制品公司，化學反應法測定血漿超氧化物歧化酶（SOD）、黃嘌呤氧化酶（XOD）活性及丙二醛（MDA）水平。術中留取的心、肝、腎、肺、腦、腸及骨骼肌組織標本置于電熱真空干燥箱（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司），60℃恒溫烘烤55 h，稱其組織干重，計算各組織的濕干重比值（W/D）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，計量資料均以均數(shù)±標準差（）表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各器官組織W/D比較 再灌注后，心、肝、腎、肺、腦、腸及骨骼肌組織的W/D均增大（均P<0.05）。SM組與I/R組比較，各組織的W/D均有所降低（均P<0.05）。見表1。

2.2 血漿SOD、XOD活性和MDA水平 與對照組比較，再灌注后血漿XOD活性和MDA水平升高，而SOD活性下降（P<0.05），但SM組與I/R組比較，血漿XOD活性和MDA水平有所降低，而SOD活性有所回升（P<0.05），見表2。

2.3 組織病理形態(tài)學變化 光鏡下觀察，對照組各標本組織結構排列整齊，染色均勻，組織間質無充血滲出。而在I/R組和SM組，鏡下可見不同程度的組織水腫、變形，組織間隙增寬，纖維蛋白滲出，大量炎性細胞浸潤，間質血管擴張、明顯充血等表現(xiàn)。各器官中，以骨骼肌組織的病理損傷性變化最為明顯，見圖1。SM組與I/R組比較，各組織水腫程度減輕，間質血管充血減輕，炎性細胞浸潤減少。

Table 1 Values of W/D ratios in samples of heart,liver,kidney,lung,brain,intestine and skeletal muscle in three groups表1 各組心、肝、腎、肺、腦、腸及骨骼肌組織W/D比較（n=8）

Table 1 Values of W/D ratios in samples of heart,liver,kidney,lung,brain,intestine and skeletal muscle in three groups表1 各組心、肝、腎、肺、腦、腸及骨骼肌組織W/D比較（n=8）

**P<0.01，3組間各組織W/D兩兩比較均P<0.05

心肝腎肺組別C組I/R組SM組F 1.34±0.10 1.61±0.08 1.43±0.19 16.382**2.44±0.14 2.94±0.22 2.73±0.17 21.365**2.32±0.16 2.65±0.11 2.44±0.18 25.231**2.74±0.13 3.01±0.20 2.83±0.20 44.512**腸組別C組I/R組SM組F腦2.55±0.20 2.79±0.21 2.68±0.11 28.127**1.45±0.16 1.79±0.12 1.53±0.21 15.213**骨骼肌3.69±0.17 3.94±0.18 3.75±0.15 48.236**

Table 2 Plasma levels of SOD,XOD and MDA in three groups表2 各組血漿SOD、XOD活性和MDA水平 （n=8）

Table 2 Plasma levels of SOD,XOD and MDA in three groups表2 各組血漿SOD、XOD活性和MDA水平 （n=8）

**P<0.01，3組間各指標兩兩比較均P<0.05

組別C組I/R組SM組F SOD（U/mL）19.90±0.97 12.47±1.55 16.42±0.37 46.078**XOD（U/L）68.28±10.43 83.31±4.93 73.63±5.37 21.743**MDA（μmol/L）4.99±0.44 7.66±0.77 6.02±0.54 24.835**

3 討論

目前，國內外有關LIR的研究多限于對某單一器官的多層次探討，同時橫向觀察和比較LIR后多器官變化的研究較少。水腫是缺血再灌注組織較為常見且明顯的病理表現(xiàn)之一，既是再灌注損傷的結果，又可嚴重影響組織細胞的功能和代謝。缺血再灌注損傷是多因素綜合作用的結果[2]，預防和治療再灌注損傷也應從多方位、多角度著手。丹參是一種目前人們公認的天然抗氧化劑，逐步被引入到再灌注損傷的研究領域中來。

Figure 1 skeletal muscle structure diagram(HE×200)圖1 骨骼肌組織結構圖（HE×200）

隨著缺血組織重新得到血液供應，氧自由基（oxygen free radical，OFR）可通過多種途徑爆發(fā)性生成，導致骨骼肌及多個遠隔器官發(fā)生過氧化損傷（peroxidation damage）[1]。本研究顯示LIR后血清MDA水平和XOD活性升高而SOD活性下降，證實了體內氧化應激狀態(tài)的形成和存在。隨著再灌注時間的延長，過氧化損傷反應可造成微血管內皮細胞結構和功能障礙，血管通透性增強，進而微血管內外液體的動態(tài)交換失平衡，多器官組織的水腫得以發(fā)生。血管外増多的組織液壓迫微血管，加上血管內血流動力學異常[3]，組織的有效血液灌流量逐漸減少，組織的損傷進一步加重，繼而導致微循環(huán)無復流現(xiàn)象（no-reflow phenome?non）的發(fā)生[4]。由此，全身各組織陷入惡性循環(huán)之中，甚至可引發(fā)多器官功能障礙綜合征（MODS）[5]。W/D是反映組織含水量多少的客觀指標，可用于檢驗組織水腫的程度，W/D與微血管內淤血及氧化損傷性微血管通透性增強等密切相關[6]。本研究檢測到LIR后多器官組織的W/D明顯增高（P<0.05），與鏡下形態(tài)學變化共同證實了器官組織水腫的發(fā)生。

大量資料表明，丹參有抗氧化、抗炎等廣泛的生物學作用[7]。本文將丹參注射液在肢體恢復血流再灌注前30 min經(jīng)尾靜脈注入動物體內，檢測發(fā)現(xiàn)血清MDA水平較未應用丹參的I/R組的檢測值明顯降低，表明體內的氧化應激程度隨著丹參的應用有所抑制，SOD因消耗減少而有所回升。此外，丹參組各個器官組織的W/D較I/R組降低，鏡下可見組織的病理損傷有所減輕。由此可推論，氧化應激參與了LIR后多器官水腫的發(fā)生；丹參作為自由基清除劑在一定程度上抑制了LIR后脂質過氧化反應及由此引發(fā)的損傷，對改善微循環(huán)、抑制組織水腫有重要作用。

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The Preventive Role of Salvia Miltiorrhiza on Multiple Organ Edema in Rats Suffered from Limb Ischemia-Reperfusion

ZHAO Lijun,KONG Xiaoyan,MEN Xiuli,LI Hongjie,WU Jing,LIU Lihua,ZHANG Lianyuan
Department of Pathophysiology,Basic Medical College of Hebei United University,Hebei 063000,China

Objective:To investigate the preventive role of salvia miltiorrhiza on multiple organ edema followed by hind limb ischemia-reperfusion(LIR)in rats.Methods:Twenty-four Wistar rats were randomly divided into 3 groups,control group(group C),ischemia-reperfusion group(group I/R)and salvia miltiorrhiza group(group SM).The model rats were made by 4 hours ischemia and 4 hours reperfusion in hind limbs.Salvia miltiorrhiza(5 mL/kg)was injected by tail vein in group SM 30 minutes before reperfusion.Animals were killed to take blood samples and take 1 gram tissues of heart,liver,kidney,lung,brain,intestine and skeletal muscle from every animal respectively.Specimens were weighed after baking(60℃,55 hours).The ratio of wet and dry(W/D)was calculated.The plasma levels of superoxide dismutase(SOD),xanthine oxidase(XOD)and malondialdehyde(MDA)were detected by biochemical methods.The morphologic changes of those tissue samples were ob?served with microscope.Results:It was found that after suffering from ischemia-reperfusion,the ratio of W/D in all speci?mens increased（P<0.05）.The plasma values of SOD decreased but XOD and MDA increased obviously（P<0.05).After LIR,structure disorder,broaden interstitial and infiltration of inflammatory cells were observed in tissues of samples.Com?pared with I/R group,the level of SOD increased and values of XOD and MDA decreased in SM group（P<0.05）.Pathologi?cal changes were reduced in all samples of tissues.Conclusion:Limb ischemia-reperfusion in rats can lead to multiple or?gan edemas,in which oxidative stress is one of the important mechanisms.Salvia miltiorrhiza might play the role of anti-ede?ma by anti-oxidation.

salvia miltiorrhiza reperfusion injury extremities edema superoxide dismutase xanthine oxidase malondialdehyde rats,Wistar

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.017

063000 唐山市，河北聯(lián)合大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室

（2011-08-01收稿 2011-12-01修回）

（本文編輯 李國琪）